Культивирование фибробластов в сфероидных повторить опухолевой ткани гораздо лучше, чем широко используется 2D-система на жесткой пластиковой. Это позволяет изучать дифференциацию фибробластов в опухолевой среде. В этом методе, жесткость клеточной культуры пластической работы не артефактно влияет на дифференциацию фибробластов.
Вместо этого, влияние взаимодействия матрицы клеток на опухоль индуцированной дифференциации фибробласта могут быть проанализированы в пробирке. Чтобы начать эту процедуру, получить клеточной культуры средств массовой информации, которая MEM дополняется 1%тепло инактивированных FBS и 1%пенициллин стрептомицин. Кроме того, получить шесть миллиграмм на миллилитр метилцеллюлозы раствор.
Смешайте одну часть метилцеллюлозы с тремя частями клеточной культуры средств массовой информации для подготовки раствора образования сфероидов. Resuspend свежеоттая увековечены нормальные фибробласты или другие типы клеток, перечисленные в текстовом протоколе в решении образования сфероидов. Если цитокины или ингибиторы интегрина включены в исследование, добавьте эти соединения в подвес клеток, чтобы влиться в сфероиды во время их формирования.
При необходимости добавьте соединения ингибиторов вместе с 10 нанограммами на миллилитр бета-версии TGF, чтобы вызвать дифференциацию в увековеченных нормальных фибробластах. Распределим 100 микролитров раствора образования сфероидов в каждую колодец круглой нижней 96 многосовой пластины. Pipette раствор в каждом хорошо вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать.
Затем инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию с 5%carbon dioxide в течение 24 часов, чтобы один сфероид, который будет сформирован в каждой хорошо. Во-первых, отрезать конец кончика пипетки, чтобы увеличить отверстие. После инкубации завершена, использовать этот разрез пипетки для сбора сфероидов в один 1,5 миллилитров реакции трубки на экспериментальное состояние или на белок, который будет проанализирован.
Центрифуга сфероидов в 1000 раз G в течение примерно 30 до 60 секунд. Тщательно удалите метилцеллюлоза, содержащую супернатант, пипетки убедившись, чтобы не беспокоить гранулированных сфероидов. Особую осторожность следует принимать при переносе сфероидов в реакционной трубке.
Убедитесь, что у вас нет ножниц дрейфа сил, разрезая кончик. Важно также, что вы собираете все сфероиды. Во время стирки шаг, убедитесь, что вы не потеряете сфероиды по стремлению.
Для мытья сфероидов добавьте 50 микролитров одного X PBS. Центрифуга при 1000 раз G в течение 30 до 60 секунд. Затем осторожно удалите PBS путем трубопроводов.
В зависимости от белка, который будет окрашен, исправить сфероиды либо с 50 микролитров 4%paraformaldehyde и PBS в течение 20 минут при комнатной температуре. Вымойте сфероиды с PBS, как описано ранее. Перемеабилизировать клетки с 0,1%triton X и PBS в течение четырех минут при комнатной температуре.
Затем, мыть сфероиды в PBS в три раза, как описано ранее. Добавьте PBS, содержащий 5%FBS и 2%BSA в сфероиды и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы блокировать неспецифические сайты взаимодействия белка. Теперь, инкубировать сфероиды с 30 микролитров первичных антител и PBS с 2,5%FBS и 1%BSA при четырех градусах по Цельсию в одночасье.
На следующий день, мыть сфероиды в PBS в три раза, как описано ранее. После этого инкубировать сфероиды с 30 микролитров вторичных антител и PBS с 2,5%FBS и 1%BSA при комнатной температуре в течение 90 минут. Вымойте сфероиды в PBS в три раза, как описано ранее.
Затем инкубировать клетки с 30 микролитров раствора окрашивания Dappy в течение четырех минут при комнатной температуре. Вымойте сфероиды в PBS один раз, как описано ранее. Используя стеклянную пипетку Pasteur, поместите сфероиды на стеклянную горку и каплю PBS.
Используйте лазерный сканирующий микроскоп для изображения сфероидов с помощью флуоресцентной микроскопии при увеличении в 10 раз. Возьмите различные оптические поперечные сечения сфероида на различных оптических равнинах стека. Репрезентативное изображение иммунофлюоресцентного окрашивания гомо сфероидов нормальных фибробластов поджелудочной железы по сравнению с гомо сфероидами увековеченного рака, связанными с фибробластами, показывает повышенный сигнал для альфа-трех подразделений в дифференцированных клетках.
Сигнал флуоресценции клеток в сфероиде затем количественно с помощью изображений стека q 3D сфероида и транскрипционных уровней интегрина альфа три субъединитных гена определяются qPCR. Все эти результаты показывают, что интегрин альфа-три регулируется в увековеченных рака, связанных с фибробластов по сравнению с нормальным коллегой. Это доказывает, что интегрин альфа три бета можно считать маркером для дифференциации фибробластов поджелудочной железы.
Этот метод идеально подходит для капитуляции самостоятельной ткани, как правило, в органах и раковых массах, где экстра-матрицы жесткость клетки определяет судьбу клеток. Культура сфероидов является универсальной моделью, которая может быть объединена с другими аналитическими анализами после сфероидной диссоциации, такой как количество ПЦР в реальном времени и полная цитометрия. Параформальдегид, используемый для фиксации сфероидов, является опасным химическим агентом.
Перчатки и износ глаз следует носить для защиты.
