По сравнению с другими методами, этот протокол легче найти новые антагонисты, агонистеры и алостерические модуляторы количественно и качественно, не зная гидро-разбавления структуры и формирования целевого белка. Этот протокол является высокоэффективным, простым в обращении, экономичным и коммерчески доступным. Объедините этот метод скрининга высокой пропускной способности с анализом ITC, функциональные небольшие пептиды могут быть получены количественно и качественно.
Демонстрацией процедуры будут Инь Чжао и Цян Ван, аспиранты нашей лаборатории. Для начала этой процедуры подготовьте раствор FGFR2 в буфере покрытия с концентрацией 10 микрограмм на миллилитр. Добавьте один миллилитр раствора в блюдо площадью 35 квадратных сантиметров и закружить несколько раз, пока поверхность не будет полностью влажной.
Инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию со тряской. На следующий день слейте раствор покрытия и добавьте подготовленный блокирующий раствор. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере один час, а затем отказаться от блокирующего раствора и быстро мыть пластину шесть раз с TBST, убедившись, что блюдо не высыхает.
Восстановить оригинальную фаговую библиотеку в один миллилитр TBST и добавить это в блюдо с покрытием. Аккуратно раскачивайте тарелку на шейкере при комнатной температуре в течение двух часов. После этого отбросьте супернатант и помойте блюдо 10 раз с помощью TBST.
Elute связанных фагом, добавив один миллилитр 0,2 молярного глицина HCL к блюду и качания мягко при комнатной температуре в течение 10 минут. Перенесите элуент в стерилизованную трубку микроцентрифуга и нейтрализуните его 100 микролитров одного моляра Tris-HCL при рН 9.1. Во-первых, довоить подготовленные пластины LB и IPTG X-Gal при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере за час до использования.
Используя наконечники пипеток с фильтром картриджей, приготовьте 100 микролитров десятикратного разбавления элюента в LB. После того, как подготовленная культура E.coli достигнет фазы среднего журнала, раздай 200 микролитров культуры в стерилизованные микроцентрифуговые трубки по одному для каждого разбавления элуента. Чтобы инициировать инфекцию, добавьте 50 микролитров каждого разбавления в трубки, содержащие культуру E.coli. Вихрь быстро и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем используйте палочки для покрытия пластин LB и IPTG X-GAL с 90 микролитров этой смеси. Через пять минут переверните пластины и инкубировать их на ночь при 37 градусах по Цельсию. Подсчитайте таблички, когда они появятся.
Для начала разбавьте ночную культуру в 20 миллилитров LB в колбе Erlenmeyer весом 250 миллилитров. Добавить неупомяненый элюент и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с энергичной тряской в течение 4-1/2 часов. Далее, центрифуга культуры в 12000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут.
Перенесите супернатант в свежую трубку. Центрифуга снова с использованием тех же условий и отказаться от гранулы. Перенесите верхние 80% супернатанта в свежую трубку и добавьте его в 1/6-й том 20%полиэтиленгликоль и 2,5 молира хлорида натрия.
Разрешить фаг осадков на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день центрифуга осаждается фагом в 12 000 раз G и 4 градуса по Цельсию в течение 15 минут. Откажитесь от супернатантов и центрифуг снова, используя те же условия.
Используйте пипетку, чтобы удалить остаточный супернатант. Повторное производство гранул в один миллилитр TBS и передачи супернатанта в микроцентрифуг трубки. Центрифуга при 12 000 раз G и четыре градуса Цельсия в течение пяти минут.
Перенесите супернатант в свежую микроцентрифугную трубку и снова осадите, добавив 1/6-й том 20%полиэтиленгликоль и 2,5 моларного хлорида натрия. Инкубировать на льду в течение 15 до 60 минут. Далее центрифуга при 12 000 раз G и четыре градуса Цельсия в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатантов и центрифуг снова, используя те же условия. Используйте пипетку, чтобы удалить остаточный супернатант. Повторное производство гранул в 200 микролитров TBS и центрифуги в течение дополнительной минуты, чтобы удалить примеси.
Затем перенесите супернатант в свежую трубку микроцентрифуга, чтобы получить усиленный элуент. В этом исследовании количество фагов сохраняется неизменным, в то время как концентрация покрытия белка FGFR2 постепенно снижается. Результаты фагового titer свидетельствуют о том, что количество восстановленных фагов постепенно увеличивается и что после трех раундов, есть 65-кратное увеличение по сравнению с первым раундом.
Затем проводится эксперимент ITC для измерения сродства небольшого пептида к FGFR2. Результаты показывают, что пептид SP1 имеет высокое сродство к FGFR2. Эти данные свидетельствуют об эффективности протокола скрининга.
Для исследования биологической активности пептида SP1 проводится анализ распространения фибробластов с использованием комплекта CCK-8. BALB/C3T3 инкубируется пептидом SP1 в различных концентрациях. Результаты показывают, что пептид SP1 подавляет рост клеток.
Загрязнения дикими фагов следует избегать здесь. Убедитесь в том, чтобы использовать аэрозольные наконечники пипетки. В то время как рост за счет получения фагов усиления.
Эта процедура также может быть использована в скрининге небольших пептидов, которые связываются с углеводами, клетками культуры и тканями. Эти пептиды могут быть дальнейшим усилением по диагностическим и целевым
