Этот протокол обеспечивает высокоэффективную бактериальную систему отображения для изоляции новых вариантов BirA, что позволяет для специфической биотинилации местных белков. Основным преимуществом техники является то, что она выбирает варианты BirA с использованием высокой сродства стрептавидина выбора. Это гарантирует, что неактивные клоны удаляются, создавая тем самым высокоэффективный процесс отбора.
Для начала, в плазмидном редакторе, спроектировать перемотку вперед, чтобы включить последние 30 нуклеотидов обратного дополнения пептидной последовательности кодирования, и добавить плазмидную связывающую нуклеотидную последовательность к ее пяти-премьер-концу. Дизайн обратной грунтовки включить первые 30 нуклеотидов обратного дополнения пептида кодирования последовательности, и добавить плазмидной связывающей нуклеотидной последовательности его пять премьер конца. Затем, чтобы настроить 20-микролитровую реакцию ПЦР, добавьте реагенты в тонкостенную трубку ПЦР.
Перенесите трубку на тепловой циклер и выполните ПЦР в соответствии с рукописью. Далее запустите пять микролитров реакции ПЦР на геля 1%agarose, чтобы подтвердить усиление шестикилограммового ПЦР-продукта, и продолжайте в соответствии с рукописью. Теперь, чтобы синтезировать мутант megaprimers с BirA гексахистидин вперед и обратной грунтовки, в трубке ПЦР, добавить одну нанограмму pBAD-BirA-eCPX с подготовленной последовательности пептида цели в качестве шаблона.
Настройка 35 циклов ПЦР с температурой 60 градусов по Цельсию в соответствии с инструкцией производителя. Затем запустите пять микролитров реакции усиления на 1%agarose гель для проверки усиления 984-базовой пары PCR продукта. Очистите продукт ПЦР от оставшихся 45 микролитров реакции усиления с помощью коммерческого комплекта очистки ПЦР и используйте спектрофотометр для количественной оценки урожайности ДНК.
В тонкостенной ПЦР трубки, добавить реагенты в подготовленных мутантов megaprimers подготовить образец реакции. Перенесите реакционной смеси на тепловой циклер, и запустить ПЦР в соответствии с рукописью. Храните реакцию усиления при четырех градусах цельсия или на льду.
Затем добавьте один микролитр фермента ограничения Dpn1 непосредственно к реакции усиления и смешайте осторожно. Спин вниз реакционной смеси, и инкубировать в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию. Через два часа преобразуйте T7 Express lysY/Iq компетентные клетки E.coli в трубку с двумя микролитров реакции Dpn1.
Во-первых, привить 100 миллилитров LB, содержащих 1%глюкозу и 100 микрограмм на миллилитр ампициллина с одним миллилитром библиотеки BirA, и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию с тряской при 200 об/мин. Затем прививают пять миллилитров LB, содержащие 1%глюкозу и 100 микрограмм на миллилитр ампициллина со 100 микролитров ночной культуры. Инкубировать в течение двух часов и 30 минут или до тех пор, пока культура достигает OD600 примерно 0,5.
Далее индуцировать eCPX и BirA выражение с 0,2% веса по объему L-арабинозы, 100-микромоляной IPTG, и 100-микромоляр биотин. Встряхните культуру при 200 об/мин в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию. Центрифуга культуры в течение 10 минут при 5000 раз г, и удалить супернатант.
Повторное распределение клеток в один миллилитр ледяной PBS, и центрифуга на 5000 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта, и повторно помесить клетки в 400 микролитров ледяной PBS, и хранить клетки на льду. Затем перенесите 10 микролитров повторно натращенных клеток в 1,5-миллилитровую трубку с маркировкой ввода.
Хранить на льду. Далее, мыть 20 микролитров стрептавидина магнитных бусин в один миллилитр ледяной PBS в трубку, и поместить трубку в скамейке магнитной частицы сепаратора в течение двух минут, и тщательно удалить супернатант. Перезаполните стрептавидин магнитными бусинами в 20 микролитров ледяного PBS и перенесите раствор шарика на предыдущие подготовленные 390 микролитров рсуспенных клеток.
Смешайте слегка пипетки. Затем инкубировать в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию. Поместите столбец с ферромагнитными сферами в сепаратор магнитных частиц и помойте пятью миллилитров ледяного PBS.
Перенесите клетки и стрептавидин магнитные бусины из трубки в колонку, прикрепленную в сепараторе. После того, как столб водохранилища пуст, мыть колонку с общим объемом пять миллилитров ледяной PBS на 500 микролитров каждый раз. После этого снимите столбец с сепаратора и поместите его в 1,5-миллилитровую трубку.
Pipette один миллилитр ледяной PBS на колонку, и использовать поршень, чтобы elute магнитно помечены клетки. Затем поместите 1,5-миллилитровую трубку в сепаратор скамейки и вымойте магнитно помеченную клетку одним миллилитром ледяного PBS. Аккуратно повторно почеркните магнитно помеченные клетки в один миллилитр ледяного PBS.
Перенесите 10 микролитров повторного незаменимия в 1,5-миллилитровую трубку с маркировкой. Прививка 100 миллилитров LB, содержащих 1%глюкозы и 100 микрограмм на миллилитр ампициллина с магнитно помечены клетки, и инкубировать ночь при 37 градусов по Цельсию с встряхивания при 200 об/мин. На следующий день, объединить 10 миллилитров ночной культуры в LB с глицеролом до окончательной концентрации 15% и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию, чтобы морозильник запасов.
Используйте 100 микролитров ночной культуры для следующего раунда отбора. Теперь добавьте 990 микролитров ледяного PBS как к входным, так и к выходным образцам, и обозначим вводимые трубы от 10 до минус двух и выход 10 до минус двух, соответственно. Сделайте 10-кратное серийное разбавление двух образцов в ледяном PBS до окончательного разбавления от 10 до минус 10, достигнутого в входной выборке и от 10 до минус четырех в выходной выборке.
Плита 100 микролитров образцов от ввода 10 до минус шести, вход 10 до минус восьми, ввод от 10 до минус 10, выход от 10 до минус двух, выход от 10 до минус трех, и выход от 10 до минус четырех на отдельных пластинах LB-ампициллина, и инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию. Утром подсчитывайте количество колоний на плитах с четко разделенными колониями. Умножьте количество колоний с фактором разбавления, чтобы получить количество бактериальной концентрации на 100 микролитров.
В этом протоколе, после генерации случайно мутировавших библиотек вариантов BirA, было индуцировано выражение BirA и eCPX-AP. Бактерии были инкубированы с реагентом сродства, несыхваченные бактерии были отброшены, и выбранные бактерии были усилены. Западная помарка pBAD-BirA-eCPX-AP выражая бактерий произвела 22-kilodalton стрептавидин-реагируя полосу в соответствии с молекулярным весом eCPX в обоих индуцированных и индуцированных культурах.
Тем не менее, они не присутствовали в BirA гексахистидин. Сильная поверхностная биотинилация в eCPX-AP, выражаюющая бактерии, вызвала агрегацию при добавлении стрептавидина магнитных бусинов и образование гранулы в нижней части трубки, которая не наблюдалась с eCPX с лизином к аланину мутации экспрессии бактерий. Анализ осадка от стрептавидина выдвижной отображается четкий 22-килодальтон стрептавидин-реагирующих и анти-гексахистидин группы в образцах из eCPX-AP культур, но не eCPX-AP с лизином аланина мутации культур.
Аналогичным образом, количество бактерий, связанных со стрептавидином бисером, было значительно выше в eCPX-AP, чем лизин eCPX-AP к культурам мутации аланина. Наиболее важным шагом является строгое мытье стрептавидин связанных бактерий. Строгая стирка гарантирует, что выбираются только бактерии с биотином с поверхностным отображением.
После того, как наблюдается четкое обогащение бактерий, изолированные клоны могут быть дополнительно мутировали и тем самым развивать высокоактивные варианты BirA, которые позволяют для специфического биотинилирования местных белков.
