СумО-связывающие сущности делают возможным изолировать эндогенные sumOylated белки in vivo. Это довольно сложно из-за наличия активных SUMO-специфической протеазы и низких фракций SUMOylated белков in vivo. Изоляция sumOylated proteome с помощью сумо-связывающих сущностей выгодна, поскольку она откладывает увеличение общего сродства к субстратам СУМО.
Это связано с тем, что SUBEs распространены в белках, которые включают тандемные повторы SIM-м, таким образом распознавая конкретно молекулы SUMO на модифицированных белках. Использование SUMO-связывающих сущностей для изоляции и характеристики SUMOylated протеом при раке печени является быстрым и чувствительным методом. Он предоставляет информацию о прошлой довольно неизвестной роли пути SUMOylation при раке печени в потенциальном терапевтическом подходе.
SumO-связывающие сущности могут быть использованы для изоляции и характеристики ПРОтеом SUMOylated в других тканях, кроме печени, как от человеческих образцов и моделей животных, так и в нескольких клеточных моделях. Хотя этот метод прост в работе, следует позаботиться при анализе нескольких образцов одного и того же типа. кулер куб на несколько этапов участие.
Поэтому мы рекомендуем тщательно выравнивать трубки перед началом этого эксперимента. Визуальная демонстрация использования связанных с СУМО сущностей облегчает революцию в этом протоколе, особенно из-за трудностей обработки битов и потери материала во время протокола. Клетки гепатомы человека были ранее подготовлены путем покрытия клеток в P100 пластин при плотности от 1,2 до 1,5 миллиона клеток на блюдо и поддерживать их в стандартных средств массовой информации роста на 37 градусов по Цельсию.
Когда готовы к использованию клеток, аспирировать средства массовой информации из пластин и мыть их с пятью миллиметрами стерильных PBS. Положите пластину на лед и добавьте 500 микролитров буфера лиза, дополненных в соответствии с рукописными указаниями. Затем используйте клеточный скребок, чтобы аккуратно соскребать клетки со дна пластины в среду лиза.
Кроме того, урожай клеток путем трипсинизации и добавить один миллилитр трипсина-ЭДТА к пластине убедившись, что клетки покрыты. Положите пластину в 37 градусов по Цельсию инкубатор в течение пяти минут, чтобы позволить им отделиться от пластины, а затем добавить два миллилитров предварительно разогретой среды роста, чтобы остановить трипсинизацию. Центрифуга клетки в 150 раз G в течение 10 минут и аспирировать супернатант.
Затем промыть клетки с PBS и центрифуги в течение еще 10 минут. Аспирировать супернатант и добавить 500 микролитров буфера лиза. Центрифуга лиза клетки при 15000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут, а затем передать supernatants в свежую трубку и отказаться от гранул.
Когда готовы к использованию собранных печени мыши, гомогенизировать 75 миллиграммов свежих или щелкнул замороженных фрагментов в один миллилитр ледяного лиза буфера. Запустите гомогенизатор в соответствии с рукописными указаниями. После гомогенизации тканей центрифуга образцов в 15000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут.
Перенесите супернатант в свежую трубку и отбросьте гранулы. Подготовка глутатиона бисера, добавив один миллилитр деионизированной воды до 70 миллиграммов бисера и воссоздать их на ночь в четыре дегресса по Цельсию. После отеков, мыть бисер три раза с 10 миллилитров деионизированной воды или PBS, центрифугирование при 300 раз G в течение пяти минут после каждой стирки.
После моет, повторное распределение бисера в один миллилитр PBS, чтобы получить 50%slurry для каждого образца на 100 микрограммов GST-SUBEs или GST управления до 100 микролитров глутатиона шарик суспензии и 500 микролитров PBS. Инкубировать смесь при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере два часа во время вращения, а затем восстановить бусы центрифугации в 300 раз G в течение пяти минут и повторно их в PBS. Возьмите 10% ранее подготовленной ячейки лисата и разбавьте его в равном объеме 3X кипящего буфера.
Добавьте 450 микролитров очищенного лизата в 100 микролитров навоза глутатиона. Инкубировать лис с бисером при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере два часа, медленно вращаясь. После инкубации, спина вниз бисера на 300 раз G в течение пяти минут и собирать супернатант для анализа.
Перенесите 10% от общего объема в отдельную трубку и добавьте равный объем 3X кипящего буфера. Вымойте оставшийся образец три раза, добавив один миллилитр ледяного PBS с 05%Tween 20 и спиннинг его вниз на 300 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты. Тщательно аспирировать супернатант убедившись, что не остается жидкости.
Затем улейте образец с 15 микролитров 3X кипящего буфера и 15 микролитров буфера лиза. Вы запустите западный анализ помарки в соответствии с рукописными указаниями. При выполнении масс-спектрометрии, desalt пептиды с помощью стадии наконечник C18 микроколумнов и повторно их в 0,1% formic кислоты до анализа.
Загрузите образцы на систему LC-MS и проанализируйте их в трипликоне. Продолжить идентификацию белка и расчет изобилия с помощью связанного программного обеспечения. Выполните статистический анализ в соответствии с рукописными указаниями.
Этот протокол был использован для изоляции SUMOylated белков у мышей с дефицитом глицина N-метилтрансферазы, которая вызывает спонтанное развитие рака печени и их диких типа littermates. Окрашивание Ponceau S было выполнено на входных, сквозных и BOUND fractions с анализа SUBEs. Западный анализ помарки LKB1, захваченный с помощью SUBEs, показывает, что уровни LKB1 SUMOylation увеличиваются в опухолях печени.
Клетки гепатомы человека и не преобразованные эпителиальные клетки печени были использованы для исследования способности SUMO-ловушки взаимодействовать с естественными белками SUMOylated. Во-первых, обычное окрашивание белка было использовано для визуализации общего материала, захваченного с SUBEs. Тогда масс-спектрометрия показала, что 742 белка были обогащены в образце гепатомы клеток SUBEs и 577 были обогащены в печени эпителиальной нетрансформированной клетки SUBEs образца.
При проведении экспериментов с SUBEs, важно поддерживать клетки и ткани на льду и добавить конкретные миллилитров в буфер лиза для того, чтобы сохранить чистоту SUMOylated. После визуализации SUMOylated proteome с SUBEs, мы можем найти характеристику, используя либо западный анализ помарки или масс-спектрометрии. Применение SUBEs для изоляции и характеристики SUMOylated протеом в тканях рака печени и гепатомы клетки прокладывает путь для изучения роли пост-трансляционных модификаций СУМО в рак печени, которые могут обеспечить потенциальный терапевтический механизм.
