Этот метод позволяет пользователю генерировать профиль содержания ядерной ДНК гепатоцитов из разделов 2D тканей для изучения развития печени, регенерации и хронических заболеваний. Этот автоматизированный подход высокой пропускной способности может быть применен ко всем 2D разделам тканей печени, обеспечивая внутренне откалиброванное считывание ядерной плоидии для всех простых круглых ядер гепатоцитов. Изменения в ядерном плоидии гепатоцитов связаны со старением, хроническими заболеваниями печени и раком.
Этот метод обеспечивает простое средство для профиля ядерной плоидии в фиксированных или криоконсервированных образцов печени. Методы профилирования на месте имеют значительный потенциал в качестве научно-исследовательских и клинических инструментов для отслеживания прогрессирования заболеваний печени, поскольку они не требуют десегрегации тканей или доступа к свежему материалу. После сбора образца ткани печени мурина, вставлять лобулы печени в оптимальной среде резки температуры заполнены криомольда и сразу же поместить плесень на сухой лед, чтобы обеспечить быстрое замораживание.
Чтобы получить кусочки образца замороженной лобулы печени, раздел образца на шесть микрометров толщиной, размещение помечены полиамида покрытием слайд над каждым образцом в течение пяти секунд, чтобы каждый образец придерживаться слайда. Когда все ломтики были собраны, позвольте образцам уравночные в течение трех-пяти минут при комнатной температуре до иммунолабеля. В конце эквилибрации зафиксировать секции тканей в дымовой капот с одним миллилитром 4%paraformaldehyde в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.
В конце фиксации, промыть слайды с тремя тремя минутами моет в PBS с нежным волнением. После последней стирки высушите область вокруг каждого участка ткани и используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать круг вокруг каждого образца. Чтобы пронизать образцы, обработать разделы с 0,5% неионных сурфактант в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.
В конце инкубации, мыть образцы в течение трех минут в PBS два раза с нежным возбуждением, как попродемонстрировано, прежде чем блокировать неспецифические связывания с фильтрованным раствором 1%бычьей сыворотки альбумена, 5%horse сыворотки, и 0,2% неионных сурфактант в PBS, по крайней мере один час при комнатной температуре. Далее, инкубировать слайды с HHF4-альфа антитела разбавленной в блокировании буфера ночь на четыре градуса по Цельсию во влажной камере окрашивания защищены от света. На следующее утро, мыть слайды четыре раза в PBS с нежным возбуждением перед инкубацией с соответствующей флуоресценции конъюгированных вторичных антител и Hoechst разбавленных в фильтрованных 1%бычьей сыворотки альбумин и 0,2%non-ionic сурфактант в PBS в течение двух часов при комнатной температуре во влажной камере окрашивания защищены от света.
В конце инкубации, мыть слайды четыре раза, как попродемонстрировано, а затем две три минуты моет в двойной дистиллированной воды с нежным волнением. После последней стирки, смонтировать образцы с двумя каплями флуоресценции монтажа среды на крышку и применять мягкое давление по мере необходимости, чтобы устранить любые пузырьки. Затем проверьте слайды с помощью обычного микроскопа флуоресценции, чтобы обеспечить хорошую фиксацию и иммунолабелирование.
Для приобретения флуоресценции изображения установите параметры на платформе изображений высокого содержания для получения изображений флуоресценции с использованием соответствующего возбуждения для используемых флюорофоров. Затем сканируйте образцы, чтобы получить достаточное количество изображений, чтобы получить полное покрытие секции ткани. В конце сканирования отрегулируйте параметры ядерной сегментации программного обеспечения, чтобы обеспечить оптимальную сегрегацию ядер и модифицировать пороговую интенсивность для обеспечения оптимального отбеливания HNF4-альфа-положительных гепатоцитов и HNF4-альфа отрицательных некаренхимальных клеток.
Для ядерной количественной оценки установите ядерную область в квадратных микрометрах на основе окрашивания Хохста, основной интенсивности ядерного Хёхста, ядерного фактора удлинивания, среднего индекса ядерной округлости, статуса HNF4-альфа и ядерных координат X, Y, основанных на центре тяжести. Для выполнения анализа ядерной плоидии гепатоцитов сначала загрузите и установите программу количественного анализа плоиди. В MATLAB перейдите на вкладку App полосы инструмента и нажмите Установите приложение.
Откройте программу Установки приложений Ploidy ML. Сообщение будет отображаться, чтобы подтвердить успешную установку. В каждом файле анализа данных, включают лист, указанный, Сотовые меры, содержащие все данные, необходимые для анализа ploidy, установленных в столбцах, как указано.
Для каждого экспериментального состояния предоставьте набор данных управления, который будет использоваться для расчета внутреннего контроля для калибровки двух-четырех N ядерных плоидов. Для биологических репликаций храните каждую электронную таблицу в своей папке, постепенно называя префиксы папки. Далее запустите приложение Ploidy.
Появится графический пользовательский интерфейс приложения Ploidy. Нажмите кнопку Путь к управлению данными, чтобы перейти к папке, в которой находятся данные управления. Затем этот путь данных появится в интерфейсе.
В Folder Prefix ввемите имя, которое будет дано файлу вывода. Нажмите кнопку «Путь к другим данным» и перейдите к папке, в которой находятся сравнительные репликации данных. Затем этот путь данных появится в интерфейсе.
Затем нажмите Run. Когда анализ будет завершен, бар «Статус» будет читать анализ завершен. После иммунолабеля важно проверить все слайды с помощью обычной микроскопии флуоресценции, чтобы подтвердить, что была получена фиксация и окрашивание хорошего качества.
Размазывание или размытие красителя Hoechst может указывать на неадекватную фиксацию или деградацию образца до фиксации. Ядерная сегрегация и параметры порога HNF4-альфа должны быть тщательно оптимизированы до автоматического анализа изображений, чтобы широко отражать визуальную структуру иммуностимулятора, наблюдаемого с помощью флуоресцентной микроскопии. После анализа изображений, данные должны отражать растущее число не-паренхимальных клеток и небольшое, но значительное, уменьшение числа HNF4-альфа-положительных ядер в печени с травмой DDC.
В здоровой печени контроля, примерно 63% HNF4-альфа положительные ядра обладают простой круговой морфометрии. Сравнение относительной ядерной плоидии между контрольными и обработанными группами DDC должно отражать значительную потерю 2C и 4C ядер гепатоцитов с повреждением вместе с увеличением числа клеток более 8C. Относительная позиционная информация для каждой подгруппы ploidy может быть допрошена путем извлечения 2D-места определенных подмножеству гепатоцитов в программном обеспечении для анализа изображений с высоким содержанием.
Иммунолабеля с дополнительными антителами, такими как Ki-67, может быть выполнена для оценки репликации клеток и гепатоцитов ядерной морфометрии данные могут быть дополнительно допрошены, чтобы хвалить анализ плоидии. Ткани всей ploidy профиль, порожденный этим методом описывает минимальное содержание ДНК для всех круговых ядер гепатоцитов, но не делает различий между моноядерными клетками и бинуклеарных гепатоцитов. Метод потенциально может быть адаптирован для учета таких параметров, как периметр клеток, для облегчения идентификации бинуклеарных клеток и обеспечения дополнительного считывания клеточной плоидии.
