この方法により、肝臓の発達、再生、慢性疾患の研究のために、2D組織のセクションから肝細胞核DNA含有量のプロファイルを生成することができます。この自動化されたハイスループットアプローチは、すべての2D肝組織切片に適用することができ、すべての単純な円形肝細胞核に対して核プロイドの内部較正された読み出しを提供する。肝細胞核プロイドの変化は、老化、慢性肝疾患、および癌に関連している。
この技術は、固定または凍結保存された肝臓標本における核プロイドをプロファイルする簡単な手段を提供する。彼らは組織分離や新鮮な材料へのアクセスを必要としないとして、その現場で策略プロファイリング方法は、肝臓病の進行を追跡するための研究や臨床ツールとしてかなりの可能性を持っています.マウス肝組織サンプルを採取した後、肝臓の小葉を最適な切断温度媒体に埋め込み、すぐにドライアイスに鋳型を置き、急速な凍結を確実にします。
凍結した肝臓の小葉サンプルのスライスを得るために、サンプルを6マイクロメートルの厚さに切り取り、各サンプルの上に5秒間コーティングされた標識ポリアミドを置き、各サンプルをスライドに貼り付ける。すべてのスライスが収集されたら、サンプルを室温で3〜5分間平衡させてから免疫標識します。平衡の終わりに、室温で10分間PBSで4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルでヒュームフードに組織切片を固定します。
固定の最後に、PBSで3分間の3分間のスケで、穏やかな攪拌でスライドをすすいだ。最後の洗浄後、各組織の部分の周りの領域を乾燥させ、疎水性ペンを使用して各サンプルの周りに円を描きます。サンプルを透過させるため、PBSで0.5%非イオン界面活性剤を室温で15分間処理します。
インキュベーションの終わりに、PBSで1%のウシ血清アルブミン、5%馬血清、および0.2%の非イオン性界面活性剤のフィルター溶液で非特異的結合を遮断する前に示すように、PBSで2分間サンプルを穏やかな攪拌で洗浄し、室温で少なくとも1時間は非イオン性界面活性剤を洗浄する。次に、HHF4-α抗体を、光から保護された湿気の多い染色チャンバーで摂氏4度で一晩ブロッキングバッファーに希釈してスライドをインキュベートします。翌朝、PBSでスライドを緩やかな攪拌でPBSで4回洗浄し、適切な蛍光共役二次抗体と、フィルター処理された1%ウシ血清アルブミンおよび0.2%非イオン性界面活性剤をPBSで希釈し、湿気の多い染色チャンバーで室温で2時間洗浄する。
インキュベーションの終わりに、スライドを実証したように4回洗浄し、続いて穏やかな攪拌で二重蒸留水で2回の3分間の洗浄を行います。最後の洗浄後、カバースリップに2滴の蛍光実装媒体を使用してサンプルを取り付け、必要に応じて穏やかな圧力をかけて気泡を除去します。次に、従来の蛍光顕微鏡を使用してスライドを確認し、良好な固定および免疫標識を確保します。
蛍光画像取得の場合、高含有画像化プラットフォーム上でパラメータを設定し、使用する蛍光色素に適した励起を用いて蛍光画像を取得します。次にサンプルをスキャンして十分な画像を取得し、組織セクションの完全なカバレッジを得る。スキャンの最後に、核が最適に分離されるようにソフトウェアの核セグメンテーションパラメータを調整し、HNF4-α陽性肝細胞およびHNF4-α陰性非パレンキマル細胞の最適なゲーティングを確実にするために閾値強度を変更します。
核定量では、重心に基づいて、Hoechst染色、主核のホークスト強度、核伸長率、平均核丸度指数、HNF4-αステータス、および核X、Y座標に基づいて、核面積を平方メートルに設定する。肝細胞核プロイド解析を実行するには、まず、プロイド定量分析プログラムをダウンロードしてインストールします。MATLAB で、ツール ストリップの [アプリ] タブに移動し、[アプリのインストール] をクリックします。
プロイディアプリケーションMLアプリケーションのインストールプログラムを開きます。インストールが成功したことを確認するメッセージが表示されます。各データ分析ファイルには、示されたとおりに列に示された策略分析に必要なすべてのデータを含む「セルメジャー」という名前のシートが含まれます。
実験条件ごとに、2 ~4 個の N 核策略の内部制御を計算するために使用する制御データセットを提供します。生物学的複製の場合は、各スプレッドシートを専用のフォルダに格納し、フォルダプレフィックスの名前を段階的に付けます。次に、プロイディアプリケーションを起動します。
Ploidy アプリケーションのグラフィカル ユーザー インターフェイスが表示されます。[コントロール データへのパス] ボタンをクリックして、コントロール データが存在するフォルダーに移動します。このデータ パスは、インターフェイスに表示されます。
[フォルダ プレフィックス] に、出力ファイルに付ける名前を入力します。[他のデータへのパス] ボタンをクリックし、比較データが存在するフォルダーに移動します。このデータ パスは、インターフェイスに表示されます。
次に、[実行] をクリックします。分析が完了すると、ステータス バーに [解析の完了] が表示されます。免疫標識後、従来の蛍光顕微鏡で全てのスライドをチェックし、良好な品質の固定と染色が得られたことを確認することが重要です。
Hoechst色素の塗り傷またはぼかしは、固定前の不十分な固定またはサンプル劣化を示すことができます。核偏析およびHNF4-α閾値パラメータは、蛍光顕微鏡で観察される免疫染色の視覚パターンを広く反映するように、自動画像分析の前に慎重に最適化する必要があります。画像分析の後、データは、非パレンキマル細胞の増加数とDDC損傷を伴う肝臓内のHNF4-α陽性核数の減少を反映する必要があります。
健康なコントロール肝臓では、HNF4-α陽性核の約63%が単純な円形の穿動を示す。対照群とDDC処理群との間の相対的な核策略の比較は、2Cおよび4C肝細胞核の有意な喪失を、8C細胞より多い数の増加とともに傷害と共に反映すべきである。各プロイドサブグループの相対位置情報は、高内容画像解析ソフトウェア内の特定の肝細胞サブセットの2D位置を取得することによって問い合わせることができる。
Ki-67などの追加抗体による免疫標識は、細胞複製を評価するために行うことができるし、肝細胞核の病変データは、策略分析を補完するためにさらに尋問することができる。この方法によって生成される組織全体の策略プロファイルは、すべての円形肝細胞核の最小DNA含有量を記述するが、単核細胞と双核肝細胞を区別しない。この方法は、細胞周囲などのパラメータを考慮して、双核細胞の同定を容易にし、細胞策略の追加の読み出しを提供するように適応することができる。
