Этот метод позволит исследователям количественно ранней динамики клеточной адгезии и распространения крепления зависимых клеток на внеклеточной матрицы белка фибронектина во время окислительного стресса. Этот метод является универсальным и может быть адаптирован для изучения цитоскелетной динамики в широком диапазоне условий. Кроме того, сбор и анализ данных осуществляется с использованием общего лабораторного оборудования и свободно доступного программного обеспечения.
Понимание механизмов, как клетки прикрепляются и распространяются на ECM во время изменений в статусе редокса, может дать ценную информацию о нормальных состояниях и состояниях болезней, таких как метастатический рак. Этот метод может быть использован для изучения распространения клеток и адгезии в различных условиях клеточной культуры, якорных линий клеток и/окислителей для ответа на широкий спектр биологических вопросов. Есть множество реагентов, необходимых для выполнения этой техники.
Поэтому важно, чтобы все решения были сделаны заранее до начала. В сертифицированном ламинарном капюшоне BSL-II установлена сертифицированная 24-колодец пластина из ткани. Поместите одну стеклянную крышку в каждый колодец.
Наклеить табличку в соответствии с рисунком 1B текстового протокола. Далее, пипетка 500 микролитров раствора фибронектина в каждую колодец. Pipette раствор над каждым coverslip несколько раз, чтобы обеспечить равномерное покрытие и полное погружение.
Накройте тарелку крышкой. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение одного часа. Затем снимите пластину с инкубатора и аспирировать раствор фибронектина из колодцев.
Вымойте скважины три раза с помощью 500 микролитров 1X PBS за стирку. Аспирировать окончательную стирку 1X PBS, и блок скважин с 500 микролитров 0,5%delipidated BSA решение при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение как минимум 15 минут. Во-первых, предварительно разогреть необходимые растворы на водяной бане при 37 градусах цельсия.
В сертифицированном ламинарном капюшоне BSL-II начните с с слияния монослой клеток REF52 в 10-квадратной сантиметровой тарелке и дважды промывте клетки шестью миллилитров теплого 1X PBS. Сыворотка голодает клетки, по крайней мере один час в шесть миллилитров теплого деликатесированного раствора BSA. Далее, мыть клетки с шестью миллилитров нагревается 1X PBS.
Аспирировать PBS и добавить 1,5 миллилитров теплого 0,5%трипсина-EDTA решение. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа в течение примерно двух минут. Наблюдайте за клетками под световым микроскопом, чтобы убедиться, что отслоение завершено.
Если клетки по-прежнему привержены после постукивания пластины на скамейке верхней, вернуть их в инкубатор в течение дополнительных двух минут. Pipette 1.5 миллилитров теплого трипсина нейтрализующий раствор, TNS, к блюду, чтобы остановить трипсинизацию и собирать отдельные клетки. Pipette раствор вверх и вниз по нижней части пластины много раз, чтобы удалить все остальные клетки адепта.
Если клетки кажутся неуклюжими, далее тритурировать подвеску клетки, мягко трубы вверх и вниз по задней части блюда. Затем подсчитайте ячейки, использующие trypan blue исключение в автоматизированном счетчике ячеек. Удалите соответствующее количество клеток для создания клеточной подвески с плотностью клеток от 10 000 до 30 000 клеток на миллилитр в делипидированной BSA в 15-миллилитровой конической трубке.
Используйте ротор с фиксированным углом в центрифуге столешницы, чтобы центрифугировать клетки 300 раз г в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно приостановить гранулы клетки в семи миллилитров теплого делипидированного раствора BSA. Затем равномерно разделите подвеску ячейки на две 15-миллилитровые конические трубки, одну для управления транспортным средством в одиночку и одну для Ku55933.
Используя трубчатый ротатор, вращайте трубки в течение 90-120 минут в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия. За 30 минут до покрытия до добавления Ku55933 и DMSO в каждую трубку до конечной концентрации 10 микромолей. Верните подвеску ячейки в ротатор на оставшееся время.
Непосредственно перед покрытием клеток, получить пластину из инкубатора и аспирировать деликатесный раствор BSA. После этого удалите 500 микролитров клеточной суспензии из каждой группы обработки и добавьте каждый из них к одному из фибронектин покрытием крышки скользит в 24-хорошо пластины. Продолжить инкубацию пластины и подвески клетки в предыдущих условиях.
Затем позвольте клеткам придерживаться крышки в течение желаемого периода времени. После того, как желаемое время для адгезии прошло, аспирировать клеточный раствор от каждого крышки в пластине. Аккуратно разбейте 500 микролитров раствора 3,7%paraformaldehyde на каждую крышку, трубя по бокам скважин, и подождите от 10 до 15 минут.
Далее, удалить раствор параформальдегида и мыть каждый coverslip дважды с 1X PBS с помощью 500 микролитров PBS за стирку. Аспирировать PBS и пермябилизированных клеток на каждом coverslip с 500 микролитров 0,2%Triton X-100 и 1X PBS в течение 10 до 15 минут при комнатной температуре. Затем мыть каждый coverslip три раза с 1X PBS с помощью 500 микролитров PBS за стирку.
Блокируйте клетки на каждой крышке с помощью 500 микролитров иммунофлуоресценции, блокирующих буфер в течение 30-60 минут. Разбавить первичное анти-паксиллин антитела в блокирующий буфер в соотношении один-к-250. Хорошо перемешать и добавить 200 микролитров раствора антитела к каждому coverslip.
Инкубация при комнатной температуре не менее одного часа. После этого, аспирировать раствор антитела и мыть каждый coverslip с 500 микролитров 1X PBS в течение 10 минут. Защитите образцы от света с этого момента вперед.
Разбавить фаллоидин F-актин зонд спрягаются с красным флуоресцентным красителем Alexa 594 и коза анти-мышь 488 флуоресцентных вторичных антител в том же блокирующего буферного раствора. Хорошо перемешайте и добавьте 200 микролитров раствора антител к каждому крышке в течение 30 минут. Аспирировать раствор антитела и мыть каждый coverslip с 500 микролитров 1X PBS в течение 10 минут.
Аспирировать PBS и промыть крышку скользит один раз с 500 микролитров деионизированной воды. Затем исправить крышку скользит на микроскоп слайды с помощью анти-fade монтажа среды, содержащей DAPI. После фиксации и окрашивания анти-паксиллин антитела, флуоресцентные 8-битные серомасштабные изображения клеток REF52 приобретаются.
По завершении всех этапов обработки изображений, отдельные фокусные спайки должны быть заметными, в фокусе, и легко отличить друг от друга. Серый флуоресценции изображения анти-paxillin и фаллоидин F-актин зонд окрашенных клеток затем принимаются после того, как покрытие на фибронектин. Известные очаговые спайки и стрессовые волокна должны быть легко видны в клетках REF52 после того, как им разрешили придерживаться фибронектина в течение 20-30 минут.
F-актин обогащенные оборками на переднем крае клеточных мембран обозначены стрелкой. Аналогичные флуоресцентные изображения фаллоидин F-актин зонд и анти-паксиллин окрашивания анализируются на процент стрессовых волокон в клеточном распространении. Примечательно, что окислиантное лечение вызывает значительное увеличение образования стрессового волокна на всех точках времени адгезии изучены, и снижение распространения клеток после 15 минут клеточной адгезии фибронектина.
Покрытие при более высокой плотности клеток приводит к клеточной скученности, которая запрещает клетки полностью распространяться из-за чрезмерного влияния. Обратите внимание, что края ячейки неотличимы от соседних ячеек. В результате, количественная оценка отдельных клеток исключается и распространение окружности не может быть точно определено.
Отдельная клеточная линия эмбриональных фибробластов мыши проводится в суспензии, а затем помойкается фибронектином в течение 30 минут. Клетки были затем исправлены и окрашены анти-paxillin антитела. Обратите внимание на внефокусные ячейки.
Кроме того, перекрестная реактивность анти-паксиллина антитела с клеточным мусором изменит пороговые значения во время количественного анализа изображений и не должна быть включена в анализ. Во время обработки изображений используйте инструмент поиска на Фиджи для изучения гистограммы изображения при корректировке яркости/контрастности, чтобы избежать ловушек, связанных с насыщенностью сигнала. Изменения в адгезии и распространении могут влиять на миграцию клеток.
Методы отслеживания миграции одноклеточных, заживления ран или анализа вторжения хемотаксиса могут определить, происходят ли изменения в миграции. Rho семьи GTPases регулировать динамику адгезии клеток через их конкретные пространственные временной активации. Фенотипические изменения в адгезии и распространения во время окислительного стресса может быть наводящий вниз по течению регулятивных ролей для этих белков.
Этот метод требует использования клеточных линий BSL-II и опасных химических реагентов. Исследователя требуют тренировки химической и биологической безопасности как обусловлено офисом здоровья и безопасности окружающей среды их заведения.
