Трудно использовать стадию инфекции хозяина T.cruzi в экспериментах потому что amastigote будет obligate внутриклеточным паразитом. Наша методика культивирования позволяет амастиготу временно размножаться за пределами клетки-хозяина, поэтому мы можем проводить эксперименты непосредственно на этой клинически релевантной стадии паразита. Демонстрацией процедуры будет yukie Akutsu, техник из нашего института.
Поддерживайте культуру паразита-хозяина в соответствии с рукописными указаниями. Когда паразит Cas9 готов к дифференциации, соберите супернатант в коническую трубку и проверьте качество образца под микроскопом. Если имеется значительное количество внеклеточных амастиготов, выполните процедуру выплыва, чтобы изолировать трипомастиготы.
Спин вниз смесь трипомастиготы и амастиготы в течение пятнадцати минут, как 2, 100 раз G.Then отказаться от большинства супернатантов, оставляя от 0,5 до 1 миллилитр среды в трубке. Свободно крышка трубки, и инкубировать гранулы при 37 градусов по Цельсию в течение одного-двух часов, что позволит активным трипомастиготы плавать из гранулы. После инкубации перенесите супернатант с трипомастиготами в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Спин его вниз, и повторно гранулы с 5 миллилитров DMEM. Перенесите паразита в культурную колбу Т-25 и инкубировать колбу при 37 градусах Цельсия под 5%углеродом в увлажненные инкубаторы. Около 95% паразитов будет дифференцироваться в амастиготы после 24 часов.
Центрифуга культуры внеклеточных амистиготов в течение 15 минут при 2, 100 раз G, и отказаться от супернатанта. Resuspend гранулы с электропорации буфера, содержащего при условии дополнения решение окончательной плотности клеток один раз от 10 до 8 клеток на миллилитр. Aliquot 100 микролитров повторного незаменимых паразитов в 1,5 литровый микроцентрифуг труб.
Затем добавьте от 5 до 10 микрограммов направляющий РНК и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Перенесите смесь на двухмиллиметровый зазор электропорации кюветта и нанесите пульс с помощью электропорации. Затем перенесите содержимое кюветта в колбу Т-25, содержащую пять миллилитров предварительной среды LIT, оставьте крышку свободной и инкубировать колбу при 37 градусах Цельсия под 5%углеродом.
Мониторинг роста клеток либо путем продолжения топорного культивирования или как внутриклеточные амастиготы после инфекции клетки-хозяина. При мониторинге роста клеток в качестве топорных амастиготов, аккуратно встряхните колбу, чтобы повторно использовать внеклеточные амастиготы в раствор, и смешайте 20 микролитров культуры с одним микролитером раствора пропидия йодида в микроцентрифуге трубки. Важно не оставлять культурную колбу за пределами инкубатора дольше, чем это необходимо, потому что температура является одним из факторов, позволяющих топорного распространения амастигота.
Нанесите образец на гемоцитометр и наблюдайте его под флуоресцентным микроскопом. Затем подсчитайте количество жизнеспособных амистиготов, которые не окрашены йодидом пропидия. Для мониторинга роста нокаут-клеток в качестве внутриклеточных амистиготов, семенной хозяин 3T3 клеток в 12-хорошо пластины с DMEM.
На следующий день после электропорации собирать нокаут амастиготы центрифугации, отказаться от супернатанта, и повторного незаменимия паразитов с двумя миллилитров DMEM. Удалите среду из культуры ячеек-хостов и добавьте перерасход амистиготов. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию под 5%углекислого газа в течение двух дней, что позволит амастиготам установить инфекцию.
После двух дней, смыть внеклеточных амастиготов за пределами принимающих клеток с DMEM, и добавить свежие DMEM. Продолжить инкубацию в течение еще двух дней, а затем визуализировать ядра клеток-хозяйни и внутриклеточных амистиготов. Было продемонстрировано, что T.Cruzi amastigotes трансфицированы с руководством РНК против основного гена TcCGM1 показать значительный дефект роста по сравнению с контрольной группой.
При мониторинге роста в качестве внутриклеточных амистиготов, доля ядер-хозяек, связанных с ядрами Т.Крузи, значительно ниже в нокаут-группе TcCGM1 по сравнению с контролем. Напротив, трансфекция направляющий РНК против одного из парафлагелярных белков стержня TcPAR1 не существенно влияет на рост клеток после четырех дней топорного культивирования или тормозит рост внутриклеточных амастиготов. Тем не менее, через пять дней после заражения, количество трипомастиготов, которые выходят из клетки-хозяина значительно ниже в TcPAR1 нокаут совместной культуры по сравнению с контролем совместной культуры.
Кроме того, дифференцированные трипомастиготы внутри ячейки-хозяина в контрольной группе оказались более активными, чем те, что в группе нокаута. Этот метод также может быть использован для изучения влияния экзогенных генов на стадии амастигота вместо трансфектирования Руководство РНК в Cas9-экспрессии амастигота, вы можете трансфект плазмида в дикий тип амастигота, чтобы выразить экзогенный ген.
