Мультиплексная флуоресцентная иммуногистохимия определяет несколько типов клеток и их расположение в нетронутой формалин-фиксированной парафин-встроенной ткани, что позволяет не только для идентификации клеток, но и клетки к клетке пространственного анализа. Основным преимуществом этой ручной техники является использование нескольких антител одного и того же вида без перекрестной реактивности. Этот метод позволяет углубленного просмотра взаимодействия иммунных и раковых клеток в микрооквидеоне опухоли.
При попытке этого метода в первый раз, позволяют примерно три-четыре дня окрашивания и отслеживать каждый шаг полностью во время процесса. Более слабый метод процесса окрашивания и мультиплексной конструкции имеет решающее значение для уменьшения распространенных и ожидаемых ловушек. Начните с депарафинизации и регидратации слайдов.
Положите их в духовку гибридизации с тканью вверх и выпекать их при температуре 60 градусов по Цельсию в течение часа. Возьмите слайды из духовки и дайте им остыть в течение пяти-десяти минут в вертикальной стойке слайда. Затем используйте слайд окрашивания набор для лечения слайдов три раза с ксиленом и один раз со 100% этанола, 95% этанола, и 70% этанола в течение 10 минут каждый.
Вымойте стойку горок с деионизированной водой, а затем исправить слайды, погружая их в нейтральный буферный формалин в течение 30 минут. Вымойте горки водой в течение двух минут и приступить к поиску антигена. Поместите стойку слайдов в жаростойкую коробку, наполненную рН 6.0 или рН 9.0 буфером поиска антигена.
Накройте коробку полиэтиленовой пленкой и закретите резинкой. Поместите коробку в микроволновую печь, оборудованную инвертором, на краю вращающейся пластины и нагревают горки в течение 45 секунд при 100%-ной мощности, а затем 15 минут при 20%мощности. Дайте слайдам остыть в течение 15-20 минут после микроволновой проема.
Между тем, подготовить рабочие решения антител и флюорофоров. Подготовка первичного разбомбления антител путем растворения 0,5 грамма гранул сыворотки крупного рогатого скота в 50 миллилитров TBST или 1X PBS. Разбавить каждое первичное антитело рабочим раствором до ранее установленной оптимизированной концентрации.
Разбавить каждый фторфор в разбавлении флюорофора при концентрации от одного до 100. В последний день окрашивания подготовьте рабочее решение DAPI, добавив три капли DAPI к одному миллилитру TBST. Как только горки остынет, удалите их из микроволновой печи и снимите полиэтиленовую пленку.
Вымойте их деионизированной водой в течение двух минут, а затем две минуты мыть с TBST. После мытья, высушить слайд вокруг ткани с деликатной задачей протрите и проследить вокруг внешней части ткани с гидрофобной пера барьер, заботясь, чтобы не прикасаться к ткани или дайте ему высохнуть. Поместите каждый слайд в камеру увлажнителя и добавьте в ткань около четырех капель блокирующего раствора.
Затем инкубировать слайды в течение 10 минут при комнатной температуре и приступить к первичному применению антител. Удалите блокирующий раствор с каждого слайда, нажав на сторону слайда на стопке бумажных полотенец и используйте деликатную протрите задачу, чтобы удалить оставшееся решение. Поместите слайд обратно в увлажненной камере, добавить около 200 микролитров работающих первичных антител, и инкубировать в течение часа.
После инкубации, мыть горки три раза, погружая их в TBST в течение двух минут за стирку. Dab от остальных TBST от каждого слайда и применять примерно три-четыре капли вторичного антитела. Инкубировать горки во влажной камере в течение 10 минут.
Вымойте слайды снова с TBST и применить около 100 микролитров фторфора рабочего решения. Верните горки во влажную камеру и инкубировать в течение 10 минут. Повторите TBST мыть, а затем микроволновой слайды в соответствии с рукописными направлениями, чтобы удалить антитела.
Важно помнить, во время этого многодневного процесса окрашивания останавливается после микроволновой ткани шаг и оставив слайды в буфер поиска антигена на ночь, обеспечивая ткань и пятно целостности. Удалить последнее применение антитела с антигеном поиска раствора и мыть горки с деионизированной водой следуют TBST в течение двух минут за стирку. Повторите окрашивание шаги для остальной части антитела флюрофор пары, а затем приступить к применению DAPI.
Нанесите на каждый слайд около 150 микролитров работающего раствора DAPI и инкубировать их во влажной камере в течение 10 минут. После инкубации, мыть слайды с TBST в течение примерно 30 секунд и смонтировать крышку скользит. После того, как монтажные средства массовой информации высохли, применять четкие ногти польский на четырех углах крышки скольжения, чтобы обеспечить его.
Чтобы проанализировать моноплекс, изображение слайдов на микроскопе с 250 миллисекундной экспозиции с использованием DAPI сосредоточиться. Оцените каждый моноплексный слайд, глядя на интенсивность флуоресценции окрашенного маркера и сравните эту интенсивность с фоном. Используйте положение слайда в окончательном мультиплексе, если интенсивность окрашенных маркеров по крайней мере в пять раз выше фона.
При окрашивание мультиплекса, выбрать подходящий порядок для каждого антитела и назначить каждый флюорофор антитела. Продолжить окрашивание мультиплекса, как описано ранее, и подготовить пустой слайд, который получает разбомжение антител, флюорофор разбомол, и TBST вместо первичных антител, фторфор, или DAPI. Когда вы будете готовы к изображению мультиплекса на микроскопе, установите экспозицию до 250 миллисекунд для всех каналов и захватите каждое изображение с помощью DAPI для фокусировки.
Затем используйте программное обеспечение для анализа для оценки каждого мультиплекса по флуоресцентным ложным цветом и по патологии зрения, которое подтвердит специфику каждого маркера. Чтобы обеспечить успех мультиплексного анализа, моноплексный анализ должен быть выполнен, чтобы определить порядок каждого антитела. Например, когда Foxp3 находится в третьей позиции массива, демонстрируется специфическое и надежное окрашивание и колокализация с помощью CD3.
В отличие от этого, когда Foxp3 находится на первой позиции, неспецифическое окрашивание Foxp3 происходит. Зернистые и эффузные области красного цвета присутствуют на большинстве слайдов, а флуоресцентная интенсивность этих областей низкая. Другим важным шагом в этом анализе является борьба с DEPI, которая является основой для идентификации клеток и дальнейшего анализа.
Между изображениями с рабочим и неработающим DAPI виден четкий контраст. Для мультиплексного анализа красивые композитные изображения не всегда отражают точное пятно. В то время как CD3 визуализируется и показывает специфическое окрашивание, патология яркого поля зрения CD163 доказывает, что антитела неспецифические.
Оптимальное мультиплексное изображение демонстрирует специфическое окрашивание в композитном изображении, а специфичность CD3 и CD163 подтверждается патологическим видом яркого поля. После этой процедуры могут быть выполнены расчеты самофэнотипирования и пространственного анализа для дальнейшего анализа взаимодействий клеток и клеток. Этот метод проложил путь для исследователей, чтобы исследовать пространственное узор клеток и нетронутых тканей, что еще больше наше понимание микроокрении опухоли иммунной.
