Этот протокол имеет важное значение, поскольку он концентрирует внеклеточные пузырьки, EVs, через сочетание технологий, позволяя при этом для отделения виньонов от EVs. Этот метод максимизирует восстановление EV выше текущего золотого стандарта ультрацентрифугации для многократного анализа вниз по течению и характеристики безвирусных подготовк EV. Этот протокол идеально подходит для изучения EV и вирусных инфекций.
Этот метод может быть адаптирован к другим вирусным системам, таким как HTLV, Эбола, Зика и многое другое. Я ожидал бы, что впервые пользователь этого метода будет бороться с подготовкой наночастиц, поэтому мы рекомендуем тщательно следовать нашим спецификациям. В зависимости от системы может потребоваться некоторая оптимизация.
Визуальная демонстрация этого метода важна для иллюстрации общего рабочего потока и нюансов протокола, что позволит сократить время и ошибки впервые пользователей. Начните с подготовки супернатанта культуры из инфицированных или трансфицированных клеток. Культура примерно 10 миллилитров поздних клеток журнала в течение пяти дней при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа, убедившись, что все средние реагенты свободны от внеклеточных пузырьков.
Когда культура будет готова, гранулы клеток центрифугации на 3000 раз G в течение пяти минут и отказаться от гранул. Фильтр супернатант с стерильным фильтром 0,22 микрометра и собирать фильтрат в чистую трубку. Добавьте равный объем реагентов осадков PEG в фильтрат и переверните трубку несколько раз, чтобы перемешать.
Инкубировать смесь при четырех градусах по Цельсию на ночь. После инкубации, центрифуга смеси в 1500 раз G в течение 30 минут, чтобы дать неоднородной внеклеточной везикулы, или EV, гранулы. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в 150-300 микролитров 1X PBS, без кальция и магния.
Держите гранулы на льду, при подготовке градиент плотности. Подготовь градиент плотности йодиксанола со 11 фракциями плотности, от 6 до 18%,йодиксанол, как описано в рукописи. Смешайте каждую трубку вихрем и слой плотности фракций в чистой и сухой размахивая ведро ультрацентрифуг трубки.
Добавьте повторно приостановленные гранулы EV в верхней части многослойного градиента и ультрацентрифуг трубки в 10 000 раз G, и четыре градуса по Цельсию в течение 90 минут. Тщательно перенесите каждую фракцию из ультрацентрифугной трубки в новую микроцентрифугную трубку. Подготовь 30% суспензии наночастиц для обогащения фракций EV, смешивая равные объемы NT80, NT82 и 1X-PBS.
Vortex наночастицы смеси для обеспечения однородности. Добавьте 30 микролитров суспензии к каждой фракции плотности и перемешайте, либо трубоубийство или инвертирование труб. Наиболее важным шагом является добавление нано-статьи, чтобы сконцентрировать EV, после разделения градиента плотности.
Без этого, EV восстановления является бедным. Поверните наночастицы, содержащие фракции плотности на ночь, при четырех градусах по Цельсию. Затем центрифуга плотности фракций на 20000 раз G в течение пяти минут при комнатной температуре.
Откажитесь от жидкости и мыть гранулы EV дважды с 1X-PBS. Чтобы подготовить гранулу к изоляции РНК, повторно приостанавливайте ее 50 микролитров автоклавной, деионизированной воды, фильтруемой и обработанной депсией, в соответствии с рукописными указаниями. РНК может быть изолирована, используя коммерческий комплект.
Для анализа с гель электрофорезом, повторно приостановить гранулы в 15 микролитров буфера Laemmli. Нагрейте образец до 95 градусов по Цельсию в течение трех минут. Повторите нагревательный шаг еще два раза, плавно вихревой и спиннинг образца вниз между тепловыми циклами.
Центрифуга образца в течение 15 секунд при 20 000 раз G, и загрузить супернатант непосредственно на гель. Для получения наилучших результатов, ограничить количество частиц, загруженных на гель, и запустить его на 100 вольт, чтобы предотвратить любые загруженные наночастицы от входа в гель. Осадки PEG позволяют значительно более эффективное восстановление EV, чем традиционная ультрацентрифугация.
При использовании 10 миллилитров культуры, этот подход приводит примерно в 500 раз выше, чем выход ультрацентрифугации. Такой подход также приводит к повышению эффективности изоляции экзосом, что проявляется в более высоких уровнях экзосомных белков маркера. Анализ Западной НОАК показывает, что увеличение CD81 в 3000 раз, увеличение CD63 в четыре раза и увеличение CD9 в 40 раз.
Кроме того, этот протокол позволяет вниз по течению исследования EV опосредованного механизмов в ВИЧ1 инфекции, путем изоляции EV от verions. Западный анализ НОАК показывает, что EV находятся в трех популяциях фракций. В то время как вирус присутствует только в двух из них.
Нарушение EV 10,8 до 12 свободны от вирусного заражения. Самое главное помнить, что наночастицы имеют решающее значение для оптимального обогащения EV. Их добавление является обязательным.
Многие анализы вниз по течению, такие как западная помарка, ПЦР, чистый диомех анализ масс-спектрометрии в пластине на основе клеточных анализов могут быть выполнены. Они позволяют использовать характеристику, механистические и/или функциональные исследования. Этот метод позволяет проводить специальные исследования, которые изучают груз EV и функциональность без загрязнения вирусного фона.
Это обеспечивает основу для изучения EV в патогенеза и развития потенциальных терапевтических средств. Чтобы преодолеть ограничения этого метода, а также применить подготовку EV и изоляцию к большим объемам, мы рекомендуем использовать передовые системы, такие как касательная фильтрация потока. Наиболее опасным инструментом для использования является ультрацентрифуг, во время разделения градиента плотности.
Убедитесь, что все центрифуги труб вес же, чтобы избежать дисбаланса и потенциального отказа ротора.
