Так как этот метод анализирует клетки из раствора, он может быть использован для изучения клеток в ближайшем родной среде. Это включает в себя анализ производных образцов клеток пациента. Этот метод практически не требует подготовки образцов клеток.
Таким образом, мы можем анализировать отдельные клетки онлайн в условиях окружающей среды, что позволяет нам исследовать клеточной неоднородности. Этот метод может быть применен для изучения жидкой биопсии из различных состояний болезни, так как он может анализировать различные типы клеток, непосредственно изолированных от образцов пациента. Для преобразования одной скважины стеклянные трубки в конические зонд с острым кончиком, первое место одной скважины стеклянной трубки в зажимы вертикального держателя пипетки, центрирование стекла по отношению к нагревательной катушки и затянуть для обеспечения трубки на месте.
Нагревательная катушка состоит из 18-калиберной проволоки сопротивления никеля хрома, обмотанные вокруг металлического стержня в 2,5 раза. Установите стеклянную трубку с температурной программой 19.5. Установите соленоидный поршень на четыре.
Триггер solenoid тянуть стеклянные трубки. Этот шаг создает два зонда, слитых на кончике. Используйте свитера, чтобы отрезать примерно один миллиметр от кончика каждого зонда, создавая отверстие диаметром около 10 микрон на кончике зонда.
Чтобы согнуть стеклянный зонд для легкого соединения с ICMP, один зонд SCMS создан. Первый набор вытащил стеклянный зонд в микрофорге. Распоить верхнюю часть примерно на три миллиметра выше платиновой теплопроводки.
Затем поверните тепло на платиновой проволоке до 30% от максимальной температуры. Согните зонд примерно на 45 градусов от исходного положения. Поместите перевернутый микроинъектор микроскопа в две системы манипуляции ячейками на моторизованном столе для легкой связи с масс-спектрометром.
Чтобы настроить устройство выбора стеклянных ячеек, вставьте зонд выбора стеклянных ячеек внутри металлического держателя микроинъектора, поместив длинный слайд в держатель капилляра и затягивая винт, чтобы обеспечить зонд на месте. Распоить наконечники зонда под углом параллельно нагретой пластине. Закрепив металлический держатель микроинжектора в клеточной системе манипуляции.
Затем распоить наконечник зонда в середине перевернутого микроскопа света. Закрепить стеклянную горку, содержащую один зонд, в зажим для рук системы манипуляции ячейками. Подключите растворитель, обеспечивающий капилляр к проводящим союзу, поместив капилляр в рукав пластикового феррула и палец, затягивая фитинг.
Соедините другую сторону проводящих союзов с капилляром, который подключен к шприцу, содержащем растворитель выборки, поместив капилляр в рукав и затягивая фитинг. Используйте ацетонитрил с 0,1% кремовой кислоты в качестве растворителя выборки в этих экспериментах. Закрети шприц в шприц-насосе на масс-спектрометре.
Распоистите ионизацию наноэлектроскопии или излучатель нано ESI примерно на один миллиметр к отверстию удлиненной ионные трубки передачи. Используйте систему манипуляции ячейками для управления спациальных движений одного зонда и позиционирования нано-излучатель ESI централизованно перед расширенной ионо-передачи труб. Пипетт клетки из колбы клеточной культуры в 15 миллилитров центрифуги трубки.
Спин клетки при 400 раз G в 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Повторное содержание клеток в четырех миллилитров RPMI среды, содержащей соединение препарата при желаемой концентрации лечения. Настройка экспериментальных параметров для масс-спектрометра.
В режиме сканирования заголовка программного обеспечения инструмента, выберите определить сканирование. Используйте разрешение 60 000 на M более 400, один микроскан 100 миллисекунд максимальное время впрыска и автоматический контроль усиления. Под шприц-насосом выберите скорость потока 150 нанолитров в минуту.
Выберите источник NSI и нанесите напряжение около 4,5 киловольт. Включите перевернутый микроскоп при 40-м увеличении, выбранном как для верхней пластины, так и для нижней линзы. Подключите его к USB-порту ноутбука для захвата видео-каналов в реальном времени.
Включите нагретую пластину и установите ее до 37 градусов по Цельсию. На компьютере перейдите на вкладку данных и выберите непрерывно в течение приобретенного времени. Чтобы подготовить образец для анализа, пипетка два-три образца в крышку небольшой чашки Петри.
Распоить образец в центре света от перевернутого микроскопа поверх нагретой пластины. Подготовь зонд выбора стеклянных клеток для анализа. Используйте систему манипуляции ячейками для перемещения зонда, чтобы его верх был сфокусирован под перевернутым микроксопом в той же плоскости, что и клетки.
Используйте систему манипуляции ячейками для перемещения наконечника зонда выбора ячейки в целевую ячейку для анализа. Этот процесс контролируется с помощью перевернутого микроскопа. Аккуратно поверните ручку микроинъектора, чтобы отрегулировать положение минерального масла внутри трубки.
Нежный всасывания обеспечивается микроиндом для обеспечения целевой ячейки к кончику зонда выбора клеток. Используйте систему манипуляции ячейки для перемещения ячейки на кончике зонда выбора ячейки к одному наконечнику зонда с помощью цифрового микроскопа, сфокусированного на одном наконечнике зонда для мониторинга этого процесса. Для создания экспериментального метода используются необработанные клетки К-562.
В типичном эксперименте SCMS, очевидные изменения спектра массы можно наблюдать от переносить клетку во время обнаружения клетчатого содержания и после заканчивать измерение. Три общих клеточных липидных пика, включая PC 34:4, PC 36:4 и PC 38:5, контролируются, чтобы обеспечить успешное перевод клетки и обнаружение клеточного содержимого. Личность многих ПК в диапазоне масс от 750 до 850 подтверждена с помощью MSMS на необработанных образцах лисата клеток.
С помощью одного зонда ICMP MS создан, Gemcitabine, Taxol и OSW1 были обнаружены после инкубации с K-562 клеток. Эти результаты показывают, что этот метод может быть использован для изучения внутриклеточных липидов, препаратов и метаболитов на уровне одной клетки из клеток в растворе в близкой родной среде. Не забудьте надежно поместить зонд выбора стеклянных клеток в универсальный держатель пипетки, так что всасывание может быть адекватно применено.
Этот метод также может быть применен к полученным пациентом образцам, чтобы различать различия между клеточными метаболитами от различных типов клеток, что позволяет нам лучше понять эти состояния заболевания. После разработки этого метода, мы могли бы потенциально реализовать количественную оценку соединений наркотиков на уровне одной клетки. При работе с клетками важно иметь соответствующее средства индивидуальной защиты, включая лабораторное пальто и перчатки.
Дополнительная одежда глаз может быть использована при работе со стеклом.
