Этот метод облегчает эффективную характеристику заболеваний, связанных с методами киназы RAF. Этот метод является очень чувствительным и воспроизводимым, экономически эффективным, удобным для пользователя и не требует какого-либо современного оборудования. Для измерения каталитической активности мутантов RAF ввемит мутации технологий флага в последовательность кодирования RAF ПЦР, прежде чем вставлять целые последовательности в соответствующий вектор в соответствии со стандартными протоколами.
Вставьте глутатион в качестве последовательности кодирования трансферазы вверх по течению последовательностей кодирования мутантов RAF, чтобы генерировать векторы, кодирующие глутатион, как трансферазы сплавленных мутантов RAF, таким же образом. Transvect 80%-90% слияние 293T клеточных культур с векторами кодирования флаг помечены RAF киназ или их мутантов, в соответствии со стандартами протоколов. После 24 часов культуры, заменить среду в каждой культуре.
После 48 часов культуры добавьте 400 микролитров буфера лиза, дополненных ингибиторами протеазы и фосфатазы, к каждому колодец на льду. Через 5-10 минут перенесите лисаты клетки в 1,5 миллилитровую трубку для центрифугации для осаждения клеточного мусора. Перенесите 300 микролитров каждого образца в отдельные 1,5 миллилитровые микро центрифуги.
Отложите 40 микролитров на образец для вниз по течению оптовой лизат ископаемых дополнительных сотовых сигнал регулируется киназы один и два выражения и активности аминокислот помарки анализа. Добавьте 20 микролитров анти-FLAG сродства шарики к каждой трубке, в течение одного часа инкубации с вращением в четыре градуса по Цельсию холодной комнате. В конце инкубации быстро и осторожно мыть анти флаг шарики один раз с лиза буфера в холодной комнате и один раз с буфером реакции киназы, прежде чем добавить 20 микролитров смеси реакции киназы.
Граф-мутанты с низким сродством Димы могут потерять каталитической активности в пробирке из-за диссоциации Димы. Поэтому быстрая и нежная стирка имеет решающее значение. После 10 минут при комнатной температуре с листать каждую минуту, остановить реакции киназы с пятью микролитерами из пяти XSDS образца буфера, на образец и варить образцы при температуре 90 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
В конце инкубации, запустить образцы на 9 до 12%polyacrylamide электрофорез гель с 0,1% SDS, а затем передать белки в мембрану нитроцеллюлозы, чтобы позволить обнаружение уровней фосфомитогена активированных белковых киназы и RAF мутантов в каждом образце, путем иммуно blotting. Для оценки алостерической активности киназы мертвых мутантов RAF, построить векторы кодирования приемник RAF или киназы мертвых активаторов RAF. Transvect 293 Т-клеток с двумя векторами кодирования как приемник RAF и киназы мертвых RAF активатор, или один вектор кодирования одного из белков, как попродемонстрировано.
Урожай всей клетки лисирует после 48 часов культуры, как попродемонстрировано, и быстро смешать чистую цельную клетку лисировать с пятью XSDS образца буфера при комнатной температуре, Перед кипячением лисаты в течение пяти минут при температуре 90 градусов по Цельсию. Затем запустите вареные образцы лизата всей клетки на 9 до 12%polyacrylamide электрофорез гель, который составляет 0,1% SDS и передачи белков в мембрану нитроцеллюлозы для обнаружения уровней фосфо дополнительный клеточный сигнал регулируется киназы один и два и контролировать белки иммунной blotting как попродемонстрировано. Для измерения относительного тусклого сродства и или стабильности RAF мутантов построить векторы кодирования флага технологий проекта мутантов сливается с конечной мизерной светлячков luciferase или C Terminus светлячок люциферазы.
Transvect 293 Т-клеток с парой векторов кодирования различных и Terminus светлячков люциферазы RAF мутантов и C Terminus светлячок люцифераза RAF мутантов, как попродемонстрировано. Через 24 часа после трансвекции реляции два раза от 10 до пятого 293 Т-клеток сделок на колодец в кристально черные пластины изображения в цвете свободной среде. Через 48 часов после трансвестиона добавьте люциферин в 293 Т-клеточные трансвектенты и инкубировать в течение 30 минут.
Перед измерением сигналов люциферазы на многофункциональной системе обнаружения. В конце измерения аспирируют супернатенты, и blice сделки 293 Т-клеток с лизас буфером, как попродемонстрировано. Вы запустите образцы лизата всей клетки на 9-12%полиакриламинидный электрофорезный гель с 0,1%SDS.
Обнаружить уровни экспрессии конечной конечной части Светлячок luciferase RAF мутантов, или C конечной светлячок люциферазы RAF мутантов анти флаг аминокислоты пятно, как попродемонстрировано. Затем нормализуйте сигналы люциферазы 293 Т-клеток трансвектантов в соответствии с уровнем экспрессии конечного срока светлячков люциферазы и C конечной части Светлячок люциферазы RAF мутантов. In vitro киназы аса может быть использован для эффективного зондирования каталитической активности некоторых constitutively активных R-позвоночник мутантов, но не то, что из киназы мертвых мутантов с сплавленной C-позвоночника.
Каталитическая активность constitutively активных мутантов RAF со слабым тусклым сродством или стабильностью, однако, не может быть исследована с помощью этого ASA, поскольку их димеры сломаны во время процесса очистки. Чтобы избежать потери каталитической активности мутантов RAF со слабым сродством или стабильностью, эти мутанты могут быть слиты с глутотионами трансферазы, чтобы спасти каталитической активности мутантов. Соактивная активация RAF ASA может быть использована для оценки алостерической активности киназы мертвых мутантов RAF.
Как иллюстрирует киназы мертвых мутантов с кислым конце терминала мотив и C синтез позвоночника, функции как алостерические активаторы, чтобы вызвать каталитической активности мутантов с не фосфора relatable кислой конце терминальный мотив, когда совместно выражается в 293T клеток. Далее бесплатный раскол люцифераза SA может быть использован для измерения относительного тусклости или стабильности RAF семьи киназы и их мутантов. Использование буфера лиза с низкой концентрацией моющего средства, и быстрая процедура мягкой стирки во время очистки образца имеет важное значение для успешного in vitro киназы SA. Этот метод поможет исследователям точно определить, как болезнь реле RAF мутантов, активировать вниз по течению пути, облегчая выбор соответствующих терапевтических стратегий для лечения заболеваний.
