В сердечных исследованиях на взрослых зебрафиш, медикаментозное лечение, как правило, делается в системном режиме. С внутриторакальной инъекцией, можно локально доставить раствор к сердцу, не вызывая повреждения миокарда. Этот метод позволяет доставать небольшие объемы препаратов, белков или других молекул в растворе именно вокруг сердца взрослой зебры.
Чтобы начать эту процедуру, используйте иглы шкив тянуть тянуть микроинъекции адаптированных борозиликат стеклянные капилляры. Храните вытащил капилляры в девяти сантиметрах Петри блюдо с рельсами моделирования глины или клейкой лентой. Используя обычные ножницы, вырезать кусок губки, и вырезать рыбу, как силуэт в его середине.
Затем приготовьте небольшие алициты инъекционных растворов с проверенными белками или другими соединениями. Отрегулируйте их концентрацию в зависимости от анализа путем разбавления вещества в 1x Hanks'balanced раствор соли дополняется 10%фенол красный. Для получения рабочей концентрации анестетики добавьте два-три миллилитра раствора трикаина в стакан, содержащий 100 миллилитров рыбной воды.
Во-первых, включите стерео микроскоп со светом сверху, и отрегулируйте увеличение до 16x. Замочите губку рыбьей водой и поместите ее на девятисемметровую чашку Петри на микроскоп. Отрегулируйте фокус, и под стерео микроскопом, используйте ножницы iridectomy для того чтобы отрезать конец microcapillary приблизительно 7 миллиметров от основания, как детализировано в рисунке 1A текстового протокола.
Вставьте разрез микрокапильярии в держатель иглы микроинъектора аппарата. Используя советы Microloader, загрузите решение управления, чтобы настроить давление инъекций, чтобы получить соответствующий поток, а затем опорожните иглу. После этого загрузите выбранный объем инъекционного раствора в кончик капилляра, убедившись, что нет пузырьков воздуха.
Используйте сетку, чтобы поймать взрослую рыбу, и передать его в обезболивающее решение. Через одну-две минуты, когда рыба перестанет плавать и движение оперкулума уменьшается, коснитесь рыбы пластиковой ложкой, чтобы убедиться, что она не реагирует на любой контакт. Далее, быстро и осторожно передать рыбу в паз мокрой губкой, с брюшной стороны вверх.
Голова рыбы должна указать от доминирующей руки оператора. Под стерео микроскопом внимательно наблюдайте за движением бьющееся сердца под кожей рыбы. Визуально определите точку инъекции над бьющимся сердцем и в середине треугольника, определяемую вентральными плотоядными пластинами.
Вставьте кончик капилляра под углом от 30 до 45 градусов относительно оси тела. Аккуратно проникайте в кожу кончиком микрокапильярия в перикард. Как только игла находится внутри перикардия, нажмите на педаль микроинъектора устройства для завершения инъекции.
После инъекции аккуратно вывяйте капилляр из грудной клетки и немедленно перенесите рыбу в резервуар с системной водой для восстановления. Мониторинг рыбы до полного восстановления после анестезии. Чтобы проанализировать эффекты инъекции, соберите сердце в нужную точку времени и подготовив его к дальнейшему анализу.
В этом исследовании, экзогенные соединения и белки поставляются в перикардиальной полости для того, чтобы изучить их влияние на сердце у взрослых зебры. Для проверки этого метода, два тестовых эксперимента выполняются путем введения цвета и флуоресцентных красителей в усыпленных рыб. В обоих анализах, цельно-монтажный анализ показывает маркировку всего сердца, включая желудочек, атриум и луковичный артерий.
Эти результаты показывают эффективное распространение инъекционных растворов на поверхности сердца. Для сравнения пригодности внутриторакальной инъекции по сравнению с внутриперитонеальной инъекцией для исследования сердца, аналогичное количество DAPI вводится с помощью обоих методов. Сердца затем фиксируются через пять минут или 120 минут.
В сердцах после внутриперитонеальной инъекции в любой момент времени не наблюдается никаких DAPI-положительных клеток. В отличие от этого, внутриторакальные инъекции приводят к наличию ядер с маркировкой DAPI в миокарде. Эти результаты показывают, что внутриторакальная инъекция улучшает доставку соединения к сердцу, по сравнению с внутриперитонеальной инъекцией.
Чтобы проверить пригодность этого метода для исследований регенерации сердца, желудочков криоинъюдных, а затем инъекции выполняются в три и семь дней после криоинджурии. И миокард, и поврежденная ткань содержат многочисленные DAPI-положительные клетки, что свидетельствует об эффективном проникновении этого красителя в нетронутое сердце и фиброзную ткань. Кроме того, инъекционный фаллоидин AF649 также включается кардиомиоцитами пери-травмы зоны и некоторые набранные фибробласты из раненых области.
Этот эксперимент показывает, что препараты могут пересекать эпикардий и проникать в основной миокард. После тестирования эффективности внутритораковых инъекций с использованием красителей анализируется влияние белков, вводимых на сердце. Для этого изучается влияние экзогенных цитокинов на различные процессы.
Биологические аспекты пролиферации кардиомиоцитов, внеклеточного осаждения матрицы, набора иммунных клеток и экспрессии кардиопротекторных генов активируются путем внутриторакальной инъекции цитокинов. Эти результаты показывают, что внутриторакальная инъекция обеспечивает подходящую стратегию для целенаправленной доставки белков для изучения их влияния на различные ткани сердца в различных анализах. Вставка иглы в перикард является ключевым шагом для успешной инъекции.
Форма иглы, угол проникновения, и прокол сайты все факторы, которые влияют на вставку иглы. После или предшествующей внутриторакальной инъекции, можно выполнить криоинджюрии для того, чтобы проанализировать влияние инъекционных молекул на регенерацию сердца. Внутриторакальная инъекция была использована в зебрафиш для изучения сердечного предпосылки.
Белок под названием CNTF был введен и было показано, для повышения цитопротекторных и про-регенеративных программ в сердце.
