Очень строгий протокол требуется, чтобы мы могли достоверно сравнить препараты от тех же животных или от разных животных или артерий в присутствии или отсутствии жира, который их окружает или в присутствии или отсутствии эндотелия. Основным преимуществом этого экспериментального метода является то, что мы можем сравнить кольца одной и той же артерии при изометрическом состоянии и таким образом достоверно сделать выводы относительно воздействия экспериментальных факторов, которые мы исследуем. Этот протокол дает представление о модуляции сосудистой отзывчивости периваскулярными жировыми тканями различных генетически модифицированных животных.
Дисфункции жировой ткани представляют собой независимый фактор риска развития гипертонии и связанных с ней сердечно-сосудистых осложнений. Наш миограф включает в себя несколько сложных шагов, которые требуют крайней осторожности в каждой точке, чтобы избежать повреждения судна, особенно во время монтажа, и обеспечить, чтобы судно адекватно реагирует на различные раздражители. Начните эту процедуру с препаратов и вскрытия мезентерических артериальных колец, как описано в текстовом протоколе.
Включите компьютер и откройте программное обеспечение для записи данных. Сохраните эксперимент в качестве файла данных лабораторной диаграммы с новым именем, чтобы избежать перезаписи исходного файла настройки. Откройте окно настроек нормализации и установите коэффициент K до одного.
Примите значения по умолчанию для калибровки IPs, целевого давления, времени онлайн-усреднения и времени задержки. Нажмите хорошо, чтобы сохранить настройки. Выберите каналы, представляющие интерес, и вечите диаметр провода, конечные точки ткани и начальные показания микрометра в окне нормализации.
Чтобы начать процедуру нормализации, нанесите первый пассивный участок на кровеносный сосуд, повернув микрометровый винт против часовой стрелки. Прожгов три минуты, пока сосуд стабилизируется, вемите новый показания микрометра в окно нормализации. Натяжение стены автоматически рассчитывается и отображается как точка на графике.
После каждого пассивного растяжения замените контрольный буфер кребса изо-осмотическим высоким калийным кребом, содержащим 150 миллимолярия хлорида калия. Когда сжатие достигает плато примерно в три минуты, завестите активную силу, вычитая пассивную силу на каждом участке из активированной силы калия. Рассчитайте напряжение стены, а также внутренние значения окружности.
Удалите высокое состояние калия, заменив высокий буфер калия свежим буфером кребса. Повторите стирку в течение трех раз в течение пяти минут. Повторите шаги нормализации, вызывая пассивные растяжения с последующим активным сокращением в альтернативных поворотах до тех пор, пока активное напряжение не начнет уменьшаться.
Тщательно промыть высокий буфер кребса калия и уравночные препараты еще 30 до 45 минут. Сброс базальных напряжения до нуля, так что только активные контрактильные ответы будут записаны во время последующего эксперимента. Подготовка и монтаж парных артериальных колец, как описано в текстовом протоколе из смежных участков каждой артерии.
Подготовка одного артериального кольца с PVAT нетронутыми, а другой с PVAT удалены. После нормализации, precontract артериальных сегментов с высоким буфером кребы калия, добавив 115 миллимолярия хлорида калия раствор в камеру, содержащую кребы. После сокращения до периода плато, промыть высокий калий и заменить буфер со свежим газированным буфером кребса.
Повторите стирку три раза в течение пяти минут. Повторите стимуляцию хлорида калия и мытье три раза и записывают максимальную контрактильный ответ на хлорид калия, вычитая базовое напряжение из напряжения из-за стимуляции хлорида калия. После последнего сокращения и мытья, пополнить камеру с теплым, газированным буфером кребса и позволить артерии восстановиться в течение 30 минут перед выполнением следующей задачи.
К каждой камере добавьте кумулятивное количество фенилэфрина, чтобы вызвать концентрационо-зависимое увеличение и изометрическое напряжение тихие препараты. После добавления последней дозы агониста, тщательно промыть препарат и пополнить камеру свежим буфером кребса. Участок концентрации зависимых ответов, как увеличение процентов хлорида калия индуцированных максимальных сокращений.
Чтобы оценить вклад оксида азота, инкубировать препараты с ингибитором синтазы оксида азота L-NAME в течение 30 минут до добавления фенилэфрина. Для выполнения второй кривой реакции концентрации последовательно, мыть камеру полностью и неоднократно, чтобы удалить все предыдущие агонисты, пока никаких дальнейших изменений в тоне не наблюдается. Нормализация отношений между длиной и напряжением была проведена для мезентерных артерий, изолированных от моделей мышей, питаемых стандартным чау или диетой с высоким содержанием жира.
Пассивная длина-напряжение отношения была установлена путем постепенного растяжения сегментов артерии до внутренней окружности, соответствующей 100 миллиметров ртутного трансмурального давления, или IC100, был получен. После каждого растяжения, 115 миллимолярия хлорида калия был применен для стимулирования сокращений. Активные кривые напряжения длины были построены на основе данных активной силы на оси Y и рассчитанных значений IC из данных микрометра на оси X.
Значение IC, лежащее в пределах пикового плато, является IC1. Коэффициент нормализации, K, был рассчитан как соотношение IC1 и IC100, которое затем может быть применено к образцам того же типа судна в последующем эксперименте. Здесь показаны выходные записи сосудосуживаемых реакций на фенилэфрин в мезентерных артериях с или без окружающих PVAT.
Совокупные концентрации фенилэфрина были применены для стимулирования сокращений мезентерных артерий, собранных у 16-недельного адипосета одной мыши. Контрактильные ответы были зарегистрированы и рассчитаны в процентах от 150 миллимолярия хлорида калия индуцированных максимальное сокращение. Область под кривыми сжатия была построена для сравнения.
Обратите внимание, что PVAT от adiposet одной мыши вызвало анти-контрактильный эффект на реакцию на фенилэфрин. При получении KCL-индуцированных сокращений, ответы должны быть стабильными и устойчивыми. Если ответ все еще увеличивается после трех дополнительных администраций KCL, стимуляция KCL может потребоваться.
Для достижения оптимальных условий напряжения очень важен этап нормализации, так как это определяет силу для открытия кровеносных сосудов. Если это не будет сделано должным образом, это повлияет на весь эксперимент. Этот протокол может быть применен к другим настройкам в дополнение к фенилэфрин-индуцированного сокращения или релаксации.
Например, при наличии или отсутствии периваскулярной жировой ткани, вегетативных нервов или эндотелия. С помощью этого протокола исследователи могут исследовать мелкие кровеносные сосуды из моделей больных животных в различных патофизиологических условиях, таких как ожирение, диабет и сердечно-сосудистые заболевания.
