Метод имеет важное значение, поскольку он позволяет нейрохимического обнаружения с высоким пространственным и временным разрешением, которые потенциально могут повысить in vivo методы нейрохимического обнаружения. Основным преимуществом этой техники является то, что это быстрый, простой и воспроизводимый метод для повышения чувствительности и временного разрешения обнаружения нейромедиатора. Демонстрацией процедуры будут Сануджа Моханарадж и Полин Вонненберг, аспиранты моей лаборатории.
Для начала разделите материал углеродного волокна на отдельные нити и вытащите из нити углеродное волокно диаметром семь микрометров. Подключите вакуумную линию к борозиликатной стеклянной капиллярной и аспирировать углеродное волокно в капилляр. Затем вырезать 10-сантиметровый на 25-сантиметровый кусок картона, чтобы служить в качестве держателя электрода.
Лента бумажное полотенце вокруг картона в качестве поддержки, а затем вставить капилляр в держатель электрода и тщательно закрепить его в вертикальной капиллярный шкив. Настройте капиллярный шкив, чтобы вытащить стеклянную капиллярную крышку к тонкому конусу для электродных материалов и запустите его. После потянув отделки и нагревательной катушки остыл, сократить углеродного волокна подключения трубки вытащил электродов.
Аккуратно удалите микроэлектроды из капиллярного шкива. Руководствуясь стереоскопом или микроскопом, используйте острые лезвия или хирургические ножницы, чтобы обрезать выступающее углеродное волокно на каждом электроде примерно до 100-150 микрометров в длину. Далее, в 25-миллилитровом флаконе, используйте ватный тампон, чтобы смешать 10 граммов эпоксидной смолы с 0,2 миллилитров затвердевания.
Заполните еще один флакон ацетоном. Для каждого электрода, погрузить кончик углеродного волокна в эпоксидной смолы в течение 15 секунд, а затем окунуть его в ацетон в течение трех секунд, чтобы удалить избыток эпоксидной смолы. После эпоксидной смолы, эпоксидные электроды затем вылечить в духовке в течение трех часов при температуре 125 градусов по Цельсию.
Далее используйте микроманипулятор для помещения микроэлектрода из углеродного волокна в серебристо-серебряно-хлоридный эталонный электрод в 0,5 миллимолярновом растворе хлороауриновой кислоты в 0,1 моларного хлорида калия. Подключите электроды к потенциастату с помощью микроэлектрода из углеродного волокна в качестве работающего электрода. Сканирование электрода от 0,2 вольт до минус одного вольта при 50 милливольт в секунду в течение 10 циклов для выполнения электродного осаждения.
Очень важно оптимизировать параметры для депонирования золотого покрытия. Слишком много покрытия вызовет шум и перегрузку сигнала в то время как слишком мало покрытия не будет способствовать нейрохимического обнаружения. Перед тестом, подготовить 10-миллимоляонный раствор запасов допамина в перхлорной кислоты и около литра рН 7,4 PBS основе буфера в деионизированной воде.
Pipette один микролитр раствора дофамина фонда в 10 миллилитров буфера, чтобы сделать примерно один раствор микромолара допамина. Затем соедините микроэлектрод из углеродного волокна и серебристо-серебряный хлоридный эталонный электрод с мощным электростатом. Зафиксите электрод углеродного волокна и эталонный электрод в головной стадии аппарата клетки потока и используйте микроманипулятор, чтобы опустить их в клетку потока.
Нарисуйте 60 миллилитров буфера PBS в шприц. Заполните ячейку потока буфером и смонтировать шприц в шприц-насосе. Начните протекать буфером через ячейку потока со скоростью одного миллилитра в минуту.
Затем настройте potentiostat для сканирования на минус 0,4 вольт до 1,3 вольт на 10 герц и 400 вольт в секунду. Кратко нанесите волновую форму на микроэлектрод, наблюдайте за осциллоскопом и отрегулируйте усиление, чтобы предотвратить перегрузку. Пусть микроэлектрод эквилибрировать в течение 10 минут в буфере.
Затем нарисуйте разбавленный раствор допамина в шприц и соедините его с инъекционным портом клетки потока. Установите общее время времени времени работать на potentiostat до 30 секунд. Начните записывать измерения, подождите 10 секунд, а затем ввемите 0,2 миллилитров раствора допамина в клетку потока.
Когда бег заканчивается, обработать данные с высокой четкости циклической вольтаметрии анализа программного обеспечения. Пусть микроэлектрод повторно эквилибрировать в течение 10 минут, прежде чем выполнять еще один тест. Когда испытания будут закончены, очистить поток ячейки путем введения трех миллилитров воды и три миллилитров воздуха в буфер и инъекционные порты в три раза.
Покрытые углеродными волокнами были изображены с помощью сканирующей электронной микроскопии. Толщина и размер частиц покрытий золотых наночастиц можно контролировать с помощью времени осаждения электрода. 20 минут электродного осаждения дали толстое золотое покрытие с острыми хребтами, в то время как пять минут дали тонкое равномерное золотое покрытие.
Микроэлектроды с покрытием золотого наночастица с углеродным волокном имели значительно более высокие пиковые окислительные токи и более быструю кинетику передачи электронов, чем неизмененные электроды. Золотое наночастицы покрытие не имело существенного влияния на стабильность реакции электрода, как попродемонстрировано здесь в растворе допамина. Оба голых и золотых наночастиц покрытием электродов ответил линейно для сканирования изменения скорости с гораздо большей величиной изменения в золотом покрытием электродов.
Это показало, что поглощение допамина может контролироваться с помощью скорости сканирования. Электроды с наночастицами, покрытые голыми и золотыми наночастицами, линейно реагировали между концентрациями допамина в 100 наномолярных до 10 микромоляров. Асимптотическая кривая наблюдалась в более высоких концентрациях, что указывает на то, что допамин перенасыщен на поверхности электрода.
Способность обнаруживать нейрохимические изменения в более быстром масштабе времени и с более высокой чувствительностью поможет ответить на сложные вопросы в неврологии. Этот метод также используется в аналитической химии, метаболомике и экологической науке. Хотя это легко узнать, визуальная демонстрация имеет решающее значение для обучения, чтобы сделать, изменить и проверить микроэлектроды.
Будущие направления для этого метода включают корректировку осаждения золота и других покрытий с учетом толщины, размера, формы и морфологии для оптимизации обнаружения конкретных нейротрансмиттеров. Исследователя должны напрактиковать регулировать малые волокна под микроскопом перед пробовать этот метод. Кроме того, нейромедиатор фондовый раствор должен быть подготовлен в дым капот, потому что они используют 1 молярной перхлорной кислоты.
