O método é significativo porque permite a detecção neuroquímica com alta resolução espacial e temporal que pode potencialmente melhorar os métodos in vivo de detecção neuroquímica. A principal vantagem dessa técnica é que é um método rápido, fácil e reprodutível para aumentar a sensibilidade e a resolução temporal da detecção de neurotransmissores. Demonstrando o procedimento estarão Sanuja Mohanaraj e Pauline Wonnenberg, estudantes de pós-graduação do meu laboratório.
Para começar, separe o material de fibra de carbono em fios individuais e puxe uma única fibra de carbono de sete micrômetros de diâmetro de um fio. Conecte uma linha de vácuo a um capilar de vidro borossilicato e aspire a fibra de carbono no capilar. Em seguida, corte um pedaço de papelão de 10 centímetros por 25 centímetros para servir como suporte de eletrodo.
Coloque uma toalha de papel ao redor do papelão como suporte, depois insira o capilar no porta-eletrodos e fixe-o cuidadosamente em um puxador capilar vertical. Configure o puxador capilar para puxar o capilar de vidro para um fino taper para materiais de eletrodos e iniciá-lo. Uma vez que o acabamento de puxar e a bobina de aquecimento tenha esfriado, corte a fibra de carbono que liga os eletrodos puxados pelo tubo.
Remova cuidadosamente os microeletros do puxador capilar. Guiado por um estereóscópio ou microscópio, use uma lâmina afiada ou uma tesoura cirúrgica para aparar a fibra de carbono salientes em cada eletrodo para cerca de 100 a 150 micrômetros de comprimento. Em seguida, em um frasco de 25 mililitros, use um cotonete para misturar 10 gramas de epóxi com 0,2 mililitros de endurecedor.
Encha outro frasco com acetona. Para cada eletrodo, mergulhe a ponta de fibra de carbono em epóxi por 15 segundos e, em seguida, mergulhe-a em acetona por três segundos para remover o excesso de epóxi. Após a epóxi, os eletrodos epóxidos são então curados no forno por três horas a 125 graus Celsius.
Em seguida, use um micromanipulador para colocar um microeletrode de fibra de carbono em um eletrodo de referência prata-prata-cloreto em uma solução de 0,5 milimolalar de ácido cloroautórico em 0,1 cloreto de potássio aquoso molar. Conecte os eletrodos a um potencialiostat com um microeletrodo de fibra de carbono como eletrodo de trabalho. Escaneie o eletrodo de 0,2 volts a menos um volt a 50 milvolts por segundo durante 10 ciclos para realizar a deposição de eletrodos.
É fundamental otimizar os parâmetros para o depósito do revestimento dourado. Muito revestimento causará ruído e sobrecarga de sinal, enquanto um pouco de revestimento não melhorará a detecção neuroquímica. Antes do teste, prepare uma solução de estoque de 10 milimolars de dopamina em ácido polemórico e cerca de um litro de tampão à base de pH 7,4 PBS em água desionizada.
Pipeta um microliter da solução de estoque de dopamina em 10 mililitros de tampão para fazer uma solução de dopamina de aproximadamente um micromolar. Em seguida, conecte uma microeletroda de fibra de carbono e um eletrodo de referência de cloreto de prata-prata a um potencialiostat. Fixar o eletrodo de fibra de carbono e o eletrodo de referência no estágio principal do aparelho celular de fluxo e usar o micromanipulador para reduzi-los para a célula de fluxo.
Desenhe 60 mililitros do buffer PBS em uma seringa. Encha a célula de fluxo com tampão e monte a seringa em uma bomba de seringa. Comece a fluir tampão através da célula de fluxo a uma taxa de um mililitro por minuto.
Em seguida, configure o potencialiostat para digitalizar para menos 0,4 volts a 1,3 volts a 10 hertz e 400 volts por segundo. Aplique brevemente a forma de onda ao microeletro, observe o osciloscópio e ajuste o ganho para evitar sobrecarga. Deixe o microeletrodo equilibrar por 10 minutos no buffer.
Em seguida, desenhe a solução de dopamina diluída em uma seringa e conecte-a à porta de injeção da célula de fluxo. Defina o tempo total de execução no potencialiostat para 30 segundos. Comece a gravar as medidas, espere 10 segundos e, em seguida, injete 0,2 mililitros de solução de dopamina na célula de fluxo.
Quando a execução terminar, processe os dados com software de análise de voltammetry cíclica de alta definição. Deixe o microeletrídro se ree equilibrar por 10 minutos antes de realizar outro teste. Quando os testes terminarem, limpe a célula de fluxo injetando três mililitros de água e três mililitros de ar nas portas tampão e injeção três vezes.
Fibras de carbono revestidas foram imagens com microscopia eletrônica de varredura. A espessura e o tamanho das partículas dos revestimentos de nanopartículas de ouro podem ser controlados pelo tempo de deposição do eletrodo. 20 minutos de deposição de eletrodos renderam um revestimento dourado espesso com cumes afiados, enquanto cinco minutos renderam um fino revestimento dourado uniforme.
As microelerodas de fibra de carbono revestidas de nanopartículas de ouro tinham correntes oxidativas de pico significativamente maiores e cinéticas de transferência de elétrons mais rápidas do que eletrodos não modificados. O revestimento de nanopartículas de ouro não teve efeito significativo na estabilidade das respostas dos eletrodos, como demonstrado aqui em uma solução de dopamina. Os eletrodos revestidos de nanopartículas nuas e douradas responderam linearmente às mudanças na taxa de varredura com uma magnitude muito maior de mudança nos eletrodos revestidos de ouro.
Isso indicou que a absorção de dopamina poderia ser controlada através da taxa de varredura. Eletrodos nus e revestidos de nanopartículas de ouro responderam linearmente entre concentrações de dopamina de 100 nanomolar a 10 micromolar. Uma curva assintomática foi observada em concentrações mais elevadas, indicando que a dopamina está supersaturada na superfície do eletrodo.
A capacidade de detectar alterações neuroquímicas em uma escala de tempo mais rápida e em sensibilidades mais altas ajudará a responder a perguntas complexas na neurociência. Este método também tem usos em química analítica, metabolômica e ciência ambiental. Embora seja fácil de aprender, a demonstração visual é fundamental para aprender a fazer, modificar e testar os microeletrous.
As direções futuras para este método incluem o ajuste da deposição de ouro e outros revestimentos para explicar a espessura, tamanho, forma e morfologia para otimizar a detecção de neurotransmissores específicos. Os pesquisadores devem praticar o manuseio de pequenas fibras sob um microscópio antes de experimentar essa técnica. Além disso, a solução de estoque neurotransmissor deve ser preparada em um capô de fumaça porque eles usam 1 ácido perclorólico molar.
