Системные исследования имеют решающее значение для глубокого понимания биологических функций. Тем не менее, для различных платформ omics требуется несколько независимых образцов, что вводит большой объем изменчивости данных. Этот метод предлагает надежную и высокопрофилитную стратегию одновременного извлечения хлорофилла, липидов, метаболитов, белков и крахмала из одного образца модели зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii.
Для извлечения хлорофилла, липидов и метаболита организуйте трубки собранных гранул клеток хламидомонаса в жидком азоте. Resuspend гранулы в каждой трубке с одним миллилитр 20 градусов извлечения буфера один. Чтобы избежать испарения буфера извлечения низкой вязкости, быстро вихрем труб до тех пор, пока клетки хорошо гомогенизированы в экстракции смеси и aliquot раствор в два миллилитров микроцентрифуг труб.
Sonicate культур в sonication ванне в ледяной воде в течение 10 минут до инкубации на орбитальном шейкере на 1000 оборотов в минуту в течение 60 минут при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации добавьте 650 микролитров буфера извлечения два и кратко вихрем образцов перед центрифугированием. Чтобы алицитировать фракции, перенесите 500 микролитров верхней липидной фазы MTBE в помеченную 1,5 миллилитровую трубку.
Используйте пипетку из 200 микролитров для удаления липидной фазы и переноса 650 микролитров нижней полярной и полуполярной фазы метаболита в новые маркированную трубку. Аспирировать избыточный объем, чтобы удалить оставшуюся нижнюю фазу и заморозить твердые гранулы в жидком азоте для хранения 80 градусов. Для определения полярного метаболита, resuspend сушеные гранулы полярной фазы в гидрохлорид метоксиамина пиридин раствор для метоксимизации групп карбонила и тепла образцов при температуре 30 градусов по Цельсию в течение 90 минут.
В конце инкубации, производные образцы с n-метил-н-трифлюорацетамид в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию в соответствии со стандартными протоколами. Для анализа первичных метаболитов используйте газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией во время полета. Для определения неполярного метаболита, resuspend сушеные гранулы неполярной фазы в смеси семь-три тома для объема ацетонитрила изопропанола и осадок гранул центрифугации.
Затем разделим образцы на обратной фазе C8 колонки на ультраперформанс жидкой хроматографии системы. Для определения содержания хлорофилла смешайте 100 микролитров фазы MTBE с 900 микролитров 90% метанола для методов пустой, а также экспериментальных образцов. Затем измерьте абсорбцион на спектрофотометре на длинах волн 655 и 652 нанометров, чтобы провести различие между хлорофиллом и хлорофиллом b и рассчитать содержание хлорофилла а и b и общее содержание хлорофилла.
Для извлечения белка растворите гранулы нижней фазы в 200 микролитров белкового буфера и инкубировать образец при комнатной температуре в течение 30 минут. В конце инкубации центрифугировать образец и перенести белково-содержащий супернатант в новую трубку. Измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
Чтобы переварить белок, уменьшить 15 микрограммов образца в пять миллимолярной дитиотрейтол в течение 30 минут, а затем алкиляции с 10 миллимолярной иодоацетамида в течение 30 минут при комнатной температуре, защищены от света. В конце алкиляции смешайте раствор трипсин/Lys-C при соотношении 25 к одному белку и инкубировать образец в течение трех часов при 37 градусах Цельсия. Разбавить образец шесть раз в 50 миллимоляр tris Hcl для ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию.
На следующее утро, прекратить пищеварение с трифтороацетической кислотой до конечной концентрации от 0,5 до 1%После пищеварения, сконцентрировать образцы почти до сухости, оставляя два-пять микролитров раствора в вакуумном концентраторе без нагрева. Повторное приостановление выборки в буфере загрузки. Проанализируйте пептидные смеси с помощью жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометра с помощью масс-спектрометра высокого разрешения, подключенного к системе нано-ультравыжимой жидкой хроматографии.
Чтобы отделить пептиды, загрузите четыре микролитера образца на 20-сантиметровую фазу заряженной поверхности гибридной колонны с внутренним диаметром 75 микрометров и размером частиц 1,7 микрометра. Используйте частичные настройки автономного цикла с изократическим градиентом, установленным на уровне 3% буфера B, удерживаемым в течение 14 минут до того, как цикл будет перенесен в онлайн-позицию с помощью столбца, после чего градиент будет увеличен линейно в течение 50 минут до тех пор, пока не будет достигнут 20%buffer B. Сдвиг в объеме клетки можно наблюдать, как клетки растут в размерах на протяжении всей фазы света, а затем освобождение клеток дочери, начиная с конца фазы света от 10 часов.
После того, как все клетки дочери были освобождены, сдвиг в объеме клеток можно наблюдать, как недавно выпущенные клетки дочери удаляются, чтобы начать следующий цикл. На основе анализа масс-спектрометрии газовой хроматографии полярной фракции в этом репрезентативном эксперименте было аннотировано 65 метаболитов. Анализ масс-спектрометрии жидкой хроматографии липидосодержащей нейтральной фазы привел к выявлению 204 различных видов липидов, охватывающих различные липидные классы.
Основной анализ компонентов может быть использован для визуализации глобальных сдвигов в метаболитах и липидах в клеточном цикле с разделением световых и темных фаз, а также полуциклических фаз, наблюдаемых как для метаболомики, так и для липидомных данных. Здесь показан обзор функционального обогащения 2 463 выявленных обогащенных белков. Оставшиеся гранулы после извлечения белка могут быть использованы для воспроизводимой количественной оценки крахмала, о чем свидетельствует низкостандартное отклонение между различными репликациями.
Важно избегать высыхания верхней органической фазы хлорофилла, так как это может повлиять на уровень хлорофилла в растворители, влияя на фактор нормализации для образцов. Для биохимической характеристики извлеченных молекулярных видов могут быть реализованы различные аналитические процедуры.
