Этот протокол описывает подготовку и анализ уникального биосенсора, который был разработан для обнаружения химических компонентов остатков огнестрельного оружия. Использование биосенсоров для судебно-медицинской экспертизы является уникальным. Он представляет собой недорогой и простой в использовании альтернативу высокоспециализированным приборам, обычно используемым в судебно-медицинских лабораториях.
Описанные методы синтетической биологии могут быть использованы для любой системы, которая использует стандартные синтетические части биологии. Описанный химический анализ применим к любому биосенсору, который выражает красный флуоресцентный белок. Демонстрация процедуры будет Андреа Соулесс и Элле Ричардсон, студенты Университета Лонгвуда.
Чтобы начать эту процедуру, добавьте десять микролитров ранее изолированной плазмидной ДНК J10060 в микроцентрифугную трубку. Добавьте восемь микролитров воды и по одному микролитеру каждого из ферментов EcoRI и NHEL, предварительно смешанных с одним микролитером буфера. Для промоутер ДНК, добавить десять микролитров annealed промоутер последовательности ДНК в свежей трубке микроцентрифуг.
Добавьте восемь микролитров воды и по одному микролитеру каждого из ферментов EcoRI и NHEL, предварительно смешанных с одним микролитером буфера. Используя пипетку, установленную до десяти микролитров, аккуратно пипетку образцы вверх и вниз, чтобы смешать. Инкубировать образцы при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
Затем нагревать и активить ферменты при температуре 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Храните переваренную ДНК в морозильной камере до готовности к работе. Во-первых, используйте плазмидную и пробирку ДНК, которые ранее переваривались, чтобы настроить реакцию в трубке микроцетифуги на льду, как указано в таблице одного из текстовых протоколов.
Убедившись, чтобы добавить T4 ДНК Ligase последний. Pipette вверх и вниз осторожно, чтобы смешать реакцию, и центрифуга кратко. Инкубировать при комнатной температуре в течение десяти минут.
Затем нагрейте и активируйте при температуре 65 градусов по Цельсию в течение десяти минут. Выполните преобразование, изложенное в текстовом протоколе. Во-первых, наведите реакционной смеси для ПЦР, как указано во второй таблице текстового протокола.
Аккуратно пипетки вверх и вниз, чтобы смешать реакции. Используя кончик желтой пипетки, соскрепайте колонию преобразованного E.coli. Перенесите салфетки этого E.coli на новую пластину Агара LB-ампициллина, которая была отрубается, а затем вставьте наконечник пипетки в трубку ПЦР.
Встряхните наконечник пипетки, чтобы смешать E.Coli с смесью ПЦР. Повторите этот процесс еще три раза для дополнительных колоний. Затем загрузите трубки ПЦР в машину ПЦР и начните термоциклинг, как указано в таблице 3 текстового протокола.
Чтобы начать маркировать соответствующее количество стерильных трубок культуры, как указано в таблице 4 текстового протокола. Добавьте в каждую трубку два миллилитров приготовленного культурного бульона. Добавьте раствор анилитного бульона в трубки, изложенные в таблице 4.
Затем поместите крышки оснастки на культурные трубки, чтобы они были свободны, чтобы поток воздуха в трубку. Vortex каждой культуры трубки. После этого поместите трубки в трясусь инкубатор при 37 градусах по Цельсию и при 220 об/мин в течение по крайней мере 24 часов.
Во-первых, используйте этанол на основе салфетки, предназначенные для удаления привести к протрите все поверхности рук, в том числе между пальцами. Храните салфетки в надлежащим образом помечены герметимые мешочек до анализа. Используйте спиртовую салфетку, чтобы вытереть любые большие поверхности для тестирования.
Используйте хлопчатобумажный своп, смоченный этанолом, чтобы вытереть любые мелкие поверхности для тестирования. Ношение чистых перчаток и с помощью ножниц, которые были очищены с алкоголем, вырезать раздел, который составляет примерно один квадратный сантиметр из центра салфетки. Затем поместите разрезанный кусок салфетки, или ватный тампон, прямо в культурную трубку, содержащую два миллилитров сенсорных бактерий, и убедитесь, что он полностью погружен в бульон.
Подготовь спектрометр для сбора флуоресцентного представления на соответствующей длине волны для варианта RFP, с возбуждением длины волны 500 нанометров. Затем используйте вихревой миксер, чтобы встряхнуть трубки. Тщательно перенесите каждый супернатант на малотометную кюветту и соберите интенсивность выбросов.
Используя вихревой миксер, встряхните трубки. Перенесите 200 микролитров бульона в колодец в хорошой тарелке. Запись, какие образцы пошли в каждый колодец этой пластины.
Настройка flourometer для сбора интенсивности выбросов на соответствующей длине волны для варианта RFP. Спектры флуоресценции для репрезентативного варианта RFP показывают как отрицательный контроль, так и спектры на двух разных уровнях анилита. Максимальный флуоресцентный сигнал для варианта RFP, используемого в этой работе, наблюдается на уровне 575 нанометров.
Репрезентативные данные собираются для одного и того же набора решений, как с портативного спектрометра, так и с флюорометра. Существует общая тенденция флуоресценции увеличивается по мере увеличения концентрации анилита. Стоит отметить, что при высоких концентрациях, больше, чем около 800 частей на миллиард для датчика свинца, ответ падает из-за токсичности свинца при такой высокой концентрации.
Анализ образцов этанолового тампона с внутренней стороны корпуса картриджа 40 калибра является доказательством принципиальных результатов. Положительные результаты от каждой из трех сенсорных бактерий, указывает на положительный тест на остатки огнестрельного оружия. Биосенсоры, подготовленные в этом протоколе, также могут использоваться индивидуально для обнаружения загрязнения образцов пищевых продуктов, воды или окружающей среды.
Этот метод прокладывает путь для исследователей для разработки биосенсоров с использованием стандартных методов синтетической биологии для различных химических анилитов. Индивидуальное защитное оборудование следует носить, а аналитикам следует мыть руки и дезинфицировать поверхности после обработки E.coli. Отходы должны быть автоматически использованы, и любые отходы, содержащие тяжелые металлы должны быть обработаны соответствующим образом.
