Автоматизированная серийная секция методов электронной микроскопии. Шаг ограничения скорости в конвейере приводит к генерации биологических трехмерных моделей обработки изображений. Наш протокол обеспечивает пошаговое руководство для получения более плотной конструкции объемов изображения всего за несколько дней.
В сочетании с подходом к количественным измерениям с использованием трехмерных моделей. С помощью этого метода, 3D структура тканей, кроме мозга, потенциально может быть проанализирована для выявления структурных нарушений, типичных для некоторых заболеваний и улучшить диагностическую стратегию. Сегментация является утомительным шагом.
Найте время, чтобы сделать его как можно более точным, чтобы избежать корректирования плохой сегментации и того, чтобы перезапустить весь процесс. Дизайн программного обеспечения иногда не очень удобно. Поэтому важно увидеть начало работы по сегментации.
Откройте стек изображений, перетащив и сбросив родной файл из микроскопа, содержащего стек или купить перетаскивания и снижается папка, содержащая весь стек изображения в окно программного обеспечения После того, как стек открыт перейти к изображению, свойства, чтобы убедиться, что размер voxels был прочитан из метаданных. Преобразуй изображение в 8-битное, нажав на изображение, ввещай и выберите 8-битный. Если исходный стек приобретается как различные плитки, нанесите швы в TrakEM2.
При необходимости создайте новый проект TrakEM2 с использованием новых, TrakEM2 с использованием встроенных функций сегмента TrakEM2. В trakEM2 в gooey, право click'on anything'under шаблон окно, и выбрать добавить новый список области ребенка'Drag и падение anything'in folder, под объектами проекта и один anything'would появится там. Перетащите и уроните, список области 'от шаблона к anything'located под объектами проекта'На viewport стека изображения, выберите курсор с курсором.
Список областей появится с уникальным идентификационный номер. Выберите brush'tool сверху и используйте мышь, чтобы сегментировать структуру, заполнив ее цитозолом по всему стеку. Экспорт сегментированных масс, которые будут использоваться в Ilastik в качестве семян для резьбы.
Для этого нажмите правой кнопкой мыши на объекте списка областей в списке «пространство» или на маске в порту представления, а также выберите export'area list'as этикетки T-I-F. В зависимости от разрешения, необходимого для дальнейших реконструкций, уменьшите размер пикселя стека изображения путем вниз выборки. Рассмотрим требования к памяти программного обеспечения, которое будет использоваться для сегментации и реконструкции.
Ilastik обрабатывает стеки до пятисот пикселей на X-Y. Примите во внимание минимальный размер, который объекты по-прежнему кажется узнаваемым и, таким образом, могут быть сегментированы. Используйте image'adjust size'To для повышения контрастности и помощи сегментации, фильтр нерезкой маски может быть применен, чтобы сделать мембраны более четкими.
Используйте process'filters'unsharp mass'Export стек изображений в качестве единого изображения'для дальнейшей обработки в программном обеспечении сегментации, используя file'save as'image sequence'и выберите формат TIFF. В главном иластик-гоу, выберите резьбу'module. Загрузите стек изображений, используя add new'and добавьте один том 3D/4D из последовательности 'Выберите весь каталог'и выберите папку, содержащую стек изображений, сохраненный в качестве одного files'At the bottom the new window, где присутствуют варианты загрузки изображений, убедитесь, что вы держите выбранный q.".
Для следующих шагов, все операции и кнопки можно найти на левой стороне основного программного обеспечения gooey. В рамках вкладки предварительной обработки используйте уже проверенные стандартные опции. Используйте яркие фильтры линий и держите шкалу фильтра на уровне 1.600.
Этот периметр может быть изменен позже. После завершения предварительной обработки выберите следующую страницу в меню выпадают из модуля маркировки. Один объект и один фон присутствуют по умолчанию.
Выберите семя объекта, нажав на него и нарисуйте линию поверх структуры интереса. Затем выберите фоновое семя и нарисуйте одну или несколько линий за пределами объекта, которые будут реконструированы. Теперь нажмите на segment'and подождите.
В зависимости от мощности компьютера и размера стека сегментация может занять от нескольких секунд до нескольких часов. Как только это будет сделано, полупрозрачная маска, подчеркивающая сегментацию, должна появиться сверху сегментированная структура. Прокрутите стек, чтобы проверить сегментацию.
Сегментация, может быть не точной, если она не следует структуре интереса или выливается из него. Исправь любой разлив, поместив фоновое семя на пролитую сегментацию. И добавить семя объекта над не реконструированным сегментом объекта, представляющим интерес.
Точное визуальное корректирование сегментации с Ilastik может быть утомительным, но важно убедиться, что экспортируемые объекты не содержат артефактов. Если сегментация все еще не верна, попробуйте изменить с bias'parameter, который увеличит или уменьшит количество неопределенных классифицированных пикселей принято. Это значение 0,95 по умолчанию.
Уменьшите его, чтобы ограничить любой побочный эффект или увеличить, если сегментация слишком консервативна. Другая возможность заключается в нажатии на preprocessing'and изменить размер фильтра. Увеличение стоимости позволит свести к минимуму соли и перца шум, как эффекты, но также сделает мембраны более размытыми и мелкие детали труднее обнаружить.
Это может ограничить побочные эффекты. Повторите столько, сколько необходимо до тех пор, пока все желаемые объекты были сегментированы. Как только объект закончен, перейдите к segment'and нажмите на сохранить текущий object'Two новые семена, как представляется, начать сегментации нового объекта.
Абстрактная поверхность измеряет сразу же, как O-B-J файлов, нажав на экспорт всех meshes'To визуализировать вручную сегментированных моделей в 3D в TrakEM2, право нажмите список области, а затем выбрать шоу в 3D'A более высокое значение будет генерировать сетку с более низким разрешением. Наконец, экспортировать 3D-сетку, как WaveFront O-B-J'by выбирая из меню file'export surfaces'WaveFront'After установки нейро морфинга инструмент комплект, как описано в текстовом протоколе, открытый блендер. Импорт объектов, использующих нейроморф партии импорта, нажав импорта objects'under меню сцены для импорта нескольких объектов одновременно.
Убедитесь в том, чтобы активировать, использовать повторной сетки и гладкой затенения. Выберите объект, представляющий интерес, из-под линии и измените глубину Octree функции повторной сетки в меню модификатора. Работайте итеративно, чтобы свести к минимуму количество vertices и избежать потери деталей в разрешении и правильной морфологии.
При изменении глубины Octree, сетка на главном gooey изменится соответствующим образом. После завершения, нажмите на применить для завершения процесса. Перейдите в меню нейроморфа на левой панели и используйте взаимодействие инструмента управления изображением инструмента изображения для загрузки стека изображений.
Убедитесь в том, чтобы ввести физический размер стека изображений для X, Y и q и выбрать путь стека, нажав на источник, где находятся ортогональные плоскости. Они не являются обязательными и загружаются только в том случае, если пользователь вставляет действительный путь. Затем выберите сетку в порту представления, нажав на нее справа.
Введите режим редактирования, нажав на вкладку, выберите одну или несколько vertices с помощью мыши правой кнопкой мыши и, наконец, нажмите на изображение шоу на вершине. Одна или несколько плоскостей с микрографом будут отображаться накладывается на верхней части сетки. Выберите плоскость разреза, нажав на нее правой кнопкой мыши.
Затем нажмите управление Y и прокрутите 3D-модель с помощью мышиного свитка. Это также может быть использовано в качестве метода корректирования. Здесь показана сегментация и реконструкция с использованием TrakEM2 и Ilastik.
TrakEM2 gooey показан с объектами, сегментированными вручную красным цветом. Экспортируемая маска может быть использована в качестве ввода для полуавтоматической сегментации. Из Ilastik маски можно экспортировать в TrakEM2 для ручного корректирования.
Маски могут быть экспортированы в качестве 3D треугольных сеток для выявить реконструированные структуры. В этом примере с помощью этого процесса были реконструированы четыре нейрона, астроциты, микроглии и перициты. Показан 3D-анализ реконструированных морфологий с использованием индивидуальных инструментов.
Вот изотропный объем изображения из сфокусированного ионно-луча, сканирующего набор данных электронной микроскопии. Плотная реконструкция этих данных показывает аксоны, астроцитатический процесс и дендриты. Этот микрограф показывает примеры целей для количественной оценки, таких как синапсы и астроцитатические гранулы гликогена.
Маска из этого микрографа показывает распределение гранул гликогена вокруг синапсов. Здесь показана графическая иллюстрация ввода и вывода графической визуализации модели поглощения лактата, полученной из гликогена, или GLAM'Here, пользователь показан в виртуальной реальности или V-R гарнитуре во время работы над плотной реконструкцией из сфокусированного набора данных ионной лучевой микроскопии. Из подмножества невритов можно наблюдать захватывающую сцену V-R.
Зеленый лазер указывает на GLAM'peak. имеет первостепенное значение, поскольку он определяет правильный размер экспортируемых 3D-объектов и определяет, что его измерения отражают его фактический размер. Концепция серийной визуализации секций, сегментации изображений и 3D-конструкции довольно старая.
Обнаружение технического ускорения приводит к достижениям в colectomies в обзоре учебников анатомии. Хотя метод был разработан для исследования мозга в электронной микроскопии, он может быть обобщен для любой и микроскопии техники генерации данных Кроме того, любой вид 3D-изображения техника может извлечь выгоду из таких сегментации изображений и строительных методов. Включая сканирование C-T и M-R-I.
