Вложенный RT-PCR был разработан для обнаружения всех лиссавирусов, включая все 16 одобренных ICTV и два новых вида лиссавирусов. Проверка этого метода была доказана с помощью более 9000 образцов мозга животных в 10 лет клинической диагностики бешенства и эпиднадзора в Китае. Вложенный RT-PCR может дать достоверный результат не только на свежих образцах тканей мозга, но и на деградированных образцах.
Затопление этот метод может быть использован для анализа биологических образцов жидкости, таких как спинномозговой жидкости, слюны и мочи, таким образом, этот метод может быть применен в ультиматум диагнозов. Для того, чтобы свести к минимуму заражение переносом ПЦР, важно подготовить отрицательный и положительный контроль Очень важно принять меры. Например, для каждого извлечения РНК требуется подготовка, ПЦР создан, и гель электрофорез должен работать в физически отдельных областях.
Рекомендуется также использовать спиральные ленты при извлечении РНК и обратной транскрипции, чтобы предотвратить заражение бешенством пептидной цепи. Правильное обращение, такие как подготовка агентов на льду, регулярное изменение перчаток, а также использование свободных от рибонуклеазы материалов предотвратит введение рибонуклеазы и устранит деградацию РНК. Чтобы начать эту процедуру, извлечь РНК из бешенства подозреваемых тканей, биопсии кожи, слюны, спинномозговой жидкости или RABV инфицированных клеточной культуры, как указано в текстовом протоколе.
Когда готовы приступить, удалить необходимые реагенты из морозильной камеры и держать их на льду. Убедитесь в том, чтобы оттепель и вихрь каждого реагента перед использованием. Для обратной транскрипции вирусной РНК к cDNA подготовить 12 микролитров реакционной смеси для каждого образца на льду и 1,5 миллилитровую центрифугу трубки, как указано в таблице 1 текстового протокола в чистой комнате.
Для учета вариаций труб, подготовить объем мастер-микс по крайней мере один размер реакции больше, чем требуется, а затем разделить смесь реакции на 0,2 миллилитров ПЦР труб. В рабочей станции PCR в комнате шаблонов добавьте восемь микролитров либо образца, либо одного из элементов управления в смесь реакции. Положительным элементом контроля является РНК, извлеченная из клеточной культуры, зараженной штаммом CVS11 с фиксированным RABV, в то время как отрицательный контроль содержит двойную дистиллированную воду без Rnase.
Смешайте содержимое каждой трубки сначала вихрем, а затем кратко центрифугой. После этого загрузите реакционной трубки в термоциклер. Настройка и запуск программы синтеза cDNA, изложенной в текстовом протоколе.
Во-первых, получить необходимые реагенты и держать их на льду в чистой комнате до готовности к использованию. Когда готовы, оттепель и вихрь реагентов. Далее подготовьте 48 микролитров смеси ПЦР первого раунда для каждого образца в 1,5 миллилитрной центрифуге трубки, изложенной в таблице 2 текстового протокола, и разделите смесь реакции на 0,2 миллилитровые трубки ПЦР.
В рабочей станции PCR в комнате шаблонов добавьте два микролитровых образца cDNA в смесь PCR первого раунда. Включите два микролитера CVS11 cDNA в качестве положительного контроля, и два микролитера двойной дистиллированной воды в качестве отрицательного контроля. Затем перенесите запечатанные трубки в термоциклер PCR и цикл, используя параметры, перечисленные в таблице 3 текстового протокола.
Для начала подготовьте 48 микролитров смеси ПЦР второго раунда для каждого образца в 1,5 миллилитрной центрифуге трубки, изложенной в таблице 4 текстового протокола, и разделите смесь реакции на 0,2 миллилитровые трубки ПЦР. Добавьте два микролитров первого раунда PCR продукта во второй раунд PCR смеси. Включите двойную дистиллированную воду в качестве отрицательного контроля для этого раунда ПЦР.
Затем выполните ПЦР-термоциклинг, используя параметры, перечисленные в таблице 3 текстового протокола. Во-первых, добавить 1,5 грамма агарозы до 100 миллилитров Трис-ацетат ЭДТА и нагреть его в микроволновой печи, чтобы растворить его тщательно. Затем добавьте бромид этидия при конечной концентрации 0,01%Налейте гель в форму и оставьте его затвердевать при температуре окружающей среды, по крайней мере 30 минут.
Подготовьте образцы загрузки, смешивая пять микролитров каждого продукта ПЦР с одним микролитром буфера загрузки 6x. Отдельно загрузите образцы и подходящий маркер ДНК в скважины и запустите гель в течение примерно 30-45 минут при 120 вольтах, пока линия красителя не составит примерно 75-80%вниз по гелю. Когда пробег будет завершен, выключите питание и отключите электроды от источника питания.
Затем аккуратно удалите гель из гелеобразной коробки. Используйте УФ-гель документирования устройства для визуализации и фотографии фрагментов ДНК. Характеризуем вложенный ПЦР обратной транскрипции, изложенный в текстовом протоколе.
Здесь показаны результаты репрезентативного вложенного РТ-ПЦР для обнаружения 18 видов лиссавирусов. Положительные элементы управления PCR показывают ожидаемую полосу на 845 базовых парах в первом раунде усиления и на 371 базовых парах для второго. Ни одна полоса не рассматривается для отрицательного контроля.
Все 18 лиссавирусов, как видно, производят те же две полосы, что и положительный контроль, что указывает на то, что вложенный RT-PCR обнаружил все 18 лиссавирусов. В то время как 16 плазмидов имеют эффективное усиление в двух раундах ПЦР, два из них, вирус Араван и вирус Икома, усиливаются только в первом или втором раунде, соответственно. Чувствительность метода варьируется при обнаружении различных плазмидов лиссавируса, от значений от 2,24 до 2 240 молекул на микролитер.
Эти различия можно отнести к несоответствиям между грунтовки и шаблоны из-за вирусного разнообразия последовательности. Сравнение 9, 624 тканей мозга из клинических образцов, которые проверяются вложенных ПЦР по сравнению с теми, которые протестированы с FAT показывает, что вложенные RT-PCR как чувствительность 100%и специфичность 99,97%В соответствии с двумя методами 99,07%Десять других лабораторий бешенства было предложено провести тест для дальнейшей проверки вложенных RT-PCR. Все десять лабораторий получили вложенные результаты RT-PCR, которые на 100% соответствуют FAT, без ложных негативов или ложных срабатываний, что указывает на то, что вложенный RT-PCR имеет высокую специфичность и воспроизводимость.
RT-PCR теперь рекомендуется МВЕ для использования технологий бешенства. И наш вложенный RT-PCR был доказан в качестве национального стандарта технологий бешенства в Китае в 2018 году.
