Анализ микронуклидов на основе потока изображений может преодолеть ряд ограничений таких методов, как автоматизированная микроскопия и традиционная цитометрия потока, включая низкую пропускную способность и отсутствие визуального подтверждения событий. Основным преимуществом этого метода является то, что все необходимые события для определения генотоксичности и цитотоксичности могут быть автоматически изображены, идентифицированы и забиты без необходимости создания микроскопических слайдов. Для воздействия клеток на кластогены и/или анеугены добавьте один миллиметр химического вещества, представляющих интерес, в семь-восемь раз от 10 до пятой части экспериментальных клеток в девяти миллилитров соответствующей клеточной культуры среды в колбе T25 и один миллилитр воды в культурах управления.
Инкубировать колбы при 37 градусах по Цельсию и пять процентов углекислого газа в течение трех часов, прежде чем передать клетки в один 15 миллилитров полипропиленовой трубки на колбу. Соберите клетки путем центрифугации и перерасход гранул в 10 миллилитров свежей среды культуры на трубку для посева в новых колбы культуры T25. Затем добавьте 150 микролитров стоковой концентрации циточалазин В в каждую колбу для достижения окончательной концентрации в три микрограмма на миллилитр.
Верните колбы в инкубатор на время восстановления в 1,5-2 раза, как это рекомендовано руководящими принципами Организации экономического сотрудничества и развития. В конце восстановительного периода перенесите культуры в отдельные 15 миллилитровых полипропилевых трубок для центрифугации и ресусендуйте гранулы в пяти миллилитров 75 миллимолярный хлорид калия. Смешайте осторожно инверсии три раза и инкубировать образцы при четырех градусах по Цельсию в течение семи минут.
В конце инкубации добавьте два миллилитра по четыре процента формалина в каждый образец и аккуратно смешайте с тремя инверсиями. Вернуть образцы до четырех градусов по Цельсию в течение 10 минут, прежде чем собирать клетки центрифугации. повторное производство гранул в 100 микролитров свежего четырехпроцентного формалина в течение 20 минут.
В конце инкубации, мыть фиксированные клетки в пять миллилитров мыть буфера на трубку центрифугации и повторно гранулы в 100 микролитров мыть буфера на трубку. Затем перенесите образцы на отдельные 1,5 миллилитровые микроцентрифуги для подсчета гемоцитометра. Добавьте пять микролитров по 100 микрограмм на миллилитр Hoechst 33342 на 1,0 х 10 до шести ячеек на миллилитр и 10 микролитров по 500 микрограмм на миллилитр RNase на 100 микролитров образца на трубку.
После 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия и пяти процентах углекислого газа центрифугает образцы в микроцентрифуге и удаляет из каждой трубки все, кроме 30 микролитров супернатанта. Затем тщательно перерасход образцов, заботясь, чтобы не вызвать образование пузыря. Если пузырьки появляются при повторном стечении, аккуратно щелкнуть трубку, чтобы удалить их.
Для запуска образцов с помощью цитометрии многоспектрального потока изображений сначала включите 405 нанометровый лазер и установите мощность лазера до 10 милливатт. Отключите все другие лазеры, включая лазер бокового рассеяния, и установите яркое поле на каналы один и девять. Подтвердите, что ползунок увеличения установлен в 60x, что режим высокой чувствительности выбран, и что только каналы один, семь и девять показывают в галерее изображений.
Нажмите участок рассеяния и выберите всю популяцию и область M01 на оси X. Выберите соотношение аспектов M01 на оси Y и нажмите квадратную область, чтобы нарисовать область вокруг отдельных ячеек. Назовите эту область одиночными ячейками и нажмите правой кнопкой мыши на участке, чтобы выбрать регионы.
Выделите область одиночных ячеек и измените координаты X на 100 и 900, а координаты Y - на 0,75 и одну. Установите параметры приобретения и укажите имя файла и папку назначения. Затем измените количество событий до 20 000, выберите положительную популяцию ДНК и запустите первый образец.
Чтобы открыть файл данных в IDEAS, нажмите Start Analysis, чтобы начать Open File Wizard, и просмотрите, чтобы выбрать нужный необработанный файл изображения. Затем нажмите Далее и просмотрите ячейку binucleated в галерее изображений. Чтобы создать маску, нажмите, чтобы выбрать интересное изображение и откройте вкладку анализа.
Нажмите маски, новые и функции, чтобы выбрать LevelSet. Под маской выберите M07 и маску среднего уровня и установите масштаб контурных деталей до трех. Затем нажмите OK два раза.
Чтобы определить количество связанных функций ячейки, откройте вкладку Анализ и выберите функции и новые. Для типа функции выберите точечный граф. Для Mask выберите окончательную маску binucleated и установите соединительность до четырех, затем измените имя на Spot Count BNC и нажмите OK и близко для расчета значений функции.
Для точечного подсчета бинуклеированной гистограммы клеток щелкните гистограмму и выберите неапоптопическую в качестве родительского населения. Для функции оси X выберите Spot Count BNC и нажмите OK и линейную область, затем нарисуйте область через Bim Two и назовите этот регион 2N. Чтобы создать маску микронуклида, выберите бинуклеированную ячейку, которая содержит микронуклей из галереи изображений, и откройте маски во вкладке Анализ.
Чтобы создать маску идентификации пятна, нажмите Кнопку Новая и Функция, и выберите Пятно. Подтвердите, что яркая радиоча кнопка выбрана, и выберите M07 под маской. Установите соотношение фона пятна к ячейке и минимальный радиус до двух и установите максимальный радиус до шести.
Нажмите OK и OK, чтобы добавить маску в список слева, а затем нажмите Кнопку New, чтобы создать другую маску. Нажмите На Spot M07 Channel 7 Яркие две шесть две маски и нажмите вниз стрелка, чтобы добавить его в определение маски и нажмите И не операторов. Нажмите на стрелку вниз, чтобы добавить расширенную маску диапазона к определению маски.
Чтобы создать полинуклеированную маску популяции, нажмите Анализ, Маски, Новые и Функции. В соответствии с функцией выберите диапазон. Под маской выберите Watershed Dilate Set M07 Channel07, Middle, three, two и установите изображение для отображения на Канале 07.
Установите минимальные и максимальные значения площади до 135 и 5000 соответственно и установите минимальные и максимальные значения соотношения сторон до 0,4 и 1, соответственно. Нажмите OK и в поле имен, изменить текст, чтобы прочитать маску POLY, а затем нажмите OK и закрыть. Чтобы создать пользовательский вид, нажмите кнопку Свойства галереи изображений, откройте вкладку Composites и нажмите кнопку New.
Под именем, введите канал 01 на канал 07. Нажмите Добавить изображение, и под изображением, выберите канал 01 и установить процент до 100. Нажмите Добавить изображение снова, и под изображением, выберите канал 07 и установить процент до 100.
Нажмите на вкладку View, нажмите Кнопку «Новое» и под именем введите маски BNC и MN. Затем нажмите Добавить колонку, и под типом изображения, выберите канал 01 и под маской, выберите Нет. Нажмите Добавить колонку, и под тип изображения, выберите канал 07, и под маской, выберите Нет.
Нажмите Добавить колонку, нажмите кнопку Композитное радио, а затем нажмите Хорошо, чтобы завершить пользовательский вид. Нажмите на меню выдвижного вида и нажмите на представление масок BNC и MN. Нажмите кнопку "Показать скрыть маски".
Чтобы перечислить ключевые события, откройте вкладку Отчеты и нажмите Define Statistics Report, затем в новом окне щелкните Добавить столбцы. Чтобы добавить статистику бинуклеированных ячеек в соответствии со Статистикой, выберите Count и под выбранным населением, выберите популяцию BNC, а затем нажмите Add Statistics, чтобы добавить статистику в список и сохранить шаблон. После того, как вся статистика была добавлена в список, нажмите Закрыть, затем нажмите OK, а затем сохранить шаблон анализа данных.
Для пакетного процесса экспериментальных файлов, в меню Инструменты, нажмите Пакет файлов данных и нажмите Добавить пакет в новом окне. Нажмите Добавить файлы, чтобы выбрать файлы эксперимента, чтобы добавить в партию и нажмите кнопку Open Folder под Выберите шаблон или опцию анализа данных. Просмотрите только что сохраненный шаблон и откройте его.
Нажмите OK, чтобы закрыть текущее окно. Затем нажмите Отправить пакеты, чтобы начать пакетную обработку всех файлов. Здесь показаны четыре выбранные панели для идентификации бинуклеированных ячеек.
Эти бивариатные участки и гистограммы позволяют отливка бинуклеированных клеток, а также идентификация тех клеток, которые имеют два ядра с аналогичной круговоротностью, областями и интенсивностями и которые хорошо отделены друг от друга. Эти изображения Брайтфилда и Хёхста, а также бинуклеированные клеточные и микронуклидные маски облегчают идентификацию и перечисление бинуклеированных клеток и микронуклидов. Применение функции точечного подсчета использует полинуклеированную маску для идентификации моноядерных, трехядерных и квадрануклеарных ячеек.
Затем можно суммировать количество три и квадрануклеарных клеток для получения окончательного количества полинуклеированных клеток, необходимых для расчета цитотоксии. Здесь показаны репрезентативные значения генотоксичности и цитотоксичности для эндогенного колхицина, кластогена митомицина С и отрицательного контроля, маннитол, чтобы продемонстрировать обоснованность протокола. Маркировка клеток с соответствующей концентрацией пятна ДНК имеет решающее значение для обеспечения высокого качества захвата изображения, что позволяет легко идентифицировать и забить все ключевые события.
Эти методы также применимы к микронуклидной анализу радиационной биодозиметрии, которая позволяет оценить дозу у людей, которые, возможно, подверглись воздействию радиации.
