Вирусные векторы могут вводить генетический материал в клетки, чтобы компенсировать дефектные гены, до-регулировать важные белки роста, или производить маркеры, которые могут проследить нейронных цепей. Внедрение вирусных векторов в нервную систему является сложной задачей из-за врожденных биологических барьеров. Прямая инъекция в ткани спинного мозга обходит эти барьеры, позволяя получить доступ к клеточным телам или синапсам.
Правильно ориентации L1 до L4 спинного уровня может быть трудно. Важно использовать ориентиры для проверки цели и помнить, что эти сегменты линии T11 до T13 позвонков. В день процедуры подключите инжектор к микрокамповке и поместите микрокамп в микроманипулятор с более весенней шкалой.
Используйте шприц с гибкой иглой, чтобы тщательно загрузить цветной краситель в одну из стеклянных игл и вставить стеклянную иглу в инжектор. Затем подтвердите, что игла посеяна правильно в шайбы, и что крышка инжектора привинчена плотно, и что стальная игла инжектора удлинено приблизительно 3/4 из длины стеклянной иглы. Перед началом процедуры, оттепель по крайней мере один микролитер, плюс небольшой объем дополнительного вируса на инъекцию из морозильной камеры хранения, и подтвердить отсутствие реакции щипать ногой в анестезированной крысы.
Бритье вдоль спинной средней линии от бедер до нижнего угла лопатки животного, потянув кожу тугой для более легкого и точного бритья, и дезинфицировать открытые кожи с последовательными 5%йода и 70%этанол скрабы. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза. Затем поместите животное на стерильную ткань и поместите марлю под мочевой пузырь, чтобы собрать мочу.
Чтобы определить место разреза кожи, осторожно нажмите пальцами на последнее ребро, чтобы найти позвонок L1. Используя этот позвонок в качестве ориентира и проведение кожи тугой, нежное распространение при нажатии твердо скальпелем, использовать номер 10 хирургического лезвия, чтобы сделать три-четыре сантиметра кожурой разрез окончание просто уступает L1 подвергать мышцы. Используйте типсы и ножницы, чтобы почувствовать спинные процессы.
Сделать небольшие ростральные разрезы, чтобы освободить место, чтобы захватить надежно на верхний процесс с крысиным зубом щипся. И сделать два длинных, глубоких сокращений как можно ближе к процессам, как это возможно. После обеспечения боковой мышцы на месте, очистить мышцы вокруг процессов, чтобы определить форму их головы.
Затем визуализировать формы головки спинных процессов для того, чтобы определить место ламинэктомии. Т11 и присоединение процессов T12 и T13 будут местом ламинэктомии. После того, как целевая область была правильно определена, осторожно распространение позвонков выявить межпозвоночных связок, и использовать rongeurs принять небольшие укусы спинных процессов и спинной аспект позвонков.
Очистите кость от средней линии, так что средняя линия кровеносный сосуд можно наблюдать, оставляя окно, которое четко показывает ткани спинного мозга и свободна от мусора. Затем закрепите стабилизирующий щипец к спинным процессам рострального и каудала к ламинэктомии окна для обеспечения животного в спинномозговой держатель. И поднимите живот животного, чтобы свести на нет эффект дыхательных движений.
Чтобы загрузить вирус в инжектор, пипетка примерно пять микролитров оттаялого бульона на кусок Parafilm, и положение стеклянные иглы так, что кончик находится внутри капли. Используйте микро-насос, чтобы снять до четырех микролитров вируса со скоростью от 20 до 100 нанолитров в секунду, и установить контроллер для инъекций, прежде чем выпустить небольшое количество вируса из иглы отзыв, чтобы убедиться, что он не заблокирован. Протрите любой избыточный вирус с помощью лабораторной салфетки и распоить микроманипуляторы так, чтобы была видна шкала vernier.
Поместите иглу в средней линии спинного мозга и используйте шкалу vernier на микроманипуляторе, чтобы направить иглу боковой 0,8 миллиметра. Затем опустите иглу к спинномозговой аккорд, пока он не отступ, но не прокол, дура, и использовать быстрое движение скручивания прокола дуры с иглой, пока кончик иглы опустился на глубину 1,5 миллиметра. После того, как игла на месте, программа инжектор для доставки вируса со скоростью 400 нанолитров в минуту, и подтвердить, что вирус входит в спинномозговой аккорд, наблюдая прогресс красителя фронта.
После того, как инъекция закончена, дайте игле отдохнуть в спинном мозге в течение двух-пяти минут, чтобы облегчить диффузию вируса, прежде чем медленно снятия иглы для позиционирования в следующем месте инъекции. После последней инъекции, удалить животное из спинного держателя, чтобы удалить любые устройства, используемые для распространения боковой мышцы. Затем закройте мышцу 4,0 хроматической шов catgut и штапель кожи с девятимиллиметровой раны клипы.
Через четыре недели после успешной инъекции, значительное выражение GFP наблюдается в нейронах в рамках серого вещества грудного спинного мозга на стороне, ипсилатеральной для инъекции. В белом материи экспрессия GFP наблюдается в аксонах в ипсилатеральной пуповине, особенно в областях, характерных для проприоспинальных аксонов. Более высокое увеличение нейронов серого вещества показывает пример типичного выражения сигнала в телах нейронных клеток и дендритах.
Выражение GFP в нейронах также может наблюдаться в ядрах ствола мозга, например, в понтийской ретикулярной образовании. Ключевыми факторами для успешной процедуры инъекции спинного мозга являются правильное ориентации позвонков и обеспечение того, чтобы вирус входит в ткани Если повреждение рострального спинного мозга выполняется до этой процедуры, прямая инъекция может быть использована для отслеживания нейронов, которые восстановить связи вокруг травмы.
