Этот протокол описывает синтез и применение PODS, новый реагент для сайта конкретных биоконъюгации белков и пептидов. Эта технология представляет собой заметное улучшение по сравнению с традиционными биосюргациями на основе малеймид-тиола. Самым большим преимуществом этой процедуры является простота, с которой изготовлен реагент.
Метод позволяет синтезировать реагент практически в любой лаборатории. В 10-миллилитровой круглой нижней колбе растворяют 100 миллиграммов аминокислоты оксадиазол тиол в трех миллилитров метанола. К раствору добавьте 360 микролитров диизопропилэтиламина и магнитный батончик.
Запечатайте колбу резиновой пробкой и перемешайте раствор в течение 10 минут при комнатной температуре. Используя одноми миллилитровый стеклянный шприц, проткните отверстие через резиновую пробку и быстро добавьте в смесь 32 микролитров идометанов. Разрешить смесь реагировать в течение 45 минут при комнатной температуре.
В 25-миллилитровой колбе круглого дна растворите 387 миллиграммов защищенной боком карбоксиновой кислоты в 10 миллилитров дихлорметана. К раствору добавьте 480 микролитров диизопропилетиламина, 264 миллиграмма ЭДКИ, 200 миллиграммов анилина и магнитного батончика. Запечатайте колбу стеклянной пробкой и дайте реакции перемешать в течение пяти дней при комнатной температуре.
Как только реакция будет завершена, перенесите реакционной смеси в сепараторную воронку, и мыть три раза с пятью миллилитров одной молярной соляной кислоты. Соберите органическую фазу и перенесите ее в разделительную воронку. Затем промойте органическую фазу одномолярным карбонатом натрия, за которым последует вода.
Затем соберите органическую фазу и добавьте сульфат магния, чтобы удалить любые следы воды. Затем профильтруйте смесь с помощью среднего стеклянного фрита. Используя роторный испаритель, удалите летучие растворители под пониженным давлением, чтобы позволить себе небелый твердый.
После этого, redissolve изолированных твердых в 10 миллилитров этилового ацетата. Затем осаждают продукт через постепенное добавление 30 миллилитров циклохексана. Фильтр решение с помощью среднего стекла фрит для получения продукта карбамат в качестве белого порошка.
В 10-миллилитровой круглой нижней колбе растворяют 30 миллиграммов карбамата в четырех миллилитров дихлорметана. Медленно добавьте в смесь 49 миллиграммов 70%-м-хлоропербензойной кислоты и магнитного батончика, и запечатайте колбу стеклянной пробкой. Перемешать раствор на ночь при комнатной температуре, в конечном итоге уступая желтую смесь.
На следующий день перенесите смесь в сепараторную воронку. Затем промыть смесь 0,1-молярным гидроксидом натрия, а затем водой. Соберите органическую фазу и добавьте сульфат магния, чтобы удалить любые следы воды.
Затем профильтруйте смесь с помощью среднего стеклянного фрита. В 25-миллилитровой круглой нижней колбе растворяют 30 миллиграммов карбамата в двух миллилитров дихлорметана. Добавить магнитный бар перемешать в смеси.
И 400 микролитров трифтороацетической кислоты и запечатать колбу стеклянной пробкой. Затем перемешать реакционной смеси при комнатной температуре в течение трех часов. Как только реакция завершена, удалите летучие веществ под пониженным давлением при комнатной температуре с помощью роторного испарителя для получения масляных остатков.
Растворите масляные остатки в семи миллилитров воды. И перенесите в разделительную воронку. Вымойте аковый раствор три раза с четырьмя миллилитров этилового ацетата.
В 1,5-миллилитровой микроцентрифуге трубки растворяют 10 миллиграммов PODS и 300 микролитров диметилсульфида. Затем добавьте в раствор 26 микролитров N, N-diisopropylethylamine. Растворите 15,2 миллиграмма DOTA NCS в 100 микролитров диметилфоксида и объедините раствор с раствором PODS.
Печать микроцентрифуг трубки, и позволяют реакции инкубировать на ночь при комнатной температуре. Далее разбавляют 61 микролитром раствора trastuzumab с 859 микролитров PBS в низко белке-связывающей 1,5-миллилитровой микроцентрифуге трубки. К этой смеси добавьте 6,7 микролитров свежеприготовленного 10-миллимолярского раствора TCEP в воду.
Добавьте в реакционной смеси 73 микролитров раствора PODS-DOTA по 1 миллиграмму на миллилитр. Наконец, запечатать трубку микроцентрифуга и инкубировать раствор в течение двух часов при комнатной температуре. Синтез PODS является надежным и надежным.
Депротеинация и замена аминофенил оксадиазола тиола позволили thioether один в количественной урожайности. Лигация thioether один и бок-защищенной карбоксиновой кислоты дали соединение два в 55%yield. Окисление позволило соединения три в 90% урожайности.
А удаление группы, защищающей бока, дало PODS в 98%-ной урожайности. Идентификация каждого продукта была подтверждена с помощью протонной ЯМР, углерода ЯМР и ms с высоким разрешением. Изотиоцианат-несущий вариант хелатора DOTA был соединен с подвесным амином PODS для получения двухфункционального хелатора в 75%-ной урожайности. Личность продукта была подтверждена с помощью протонной ЯМР, углерода ЯМР и MS с высоким разрешением. Сайт-селективной биосюджации PODS-DOTA к HER2-таргетинга антитела trastuzumab показано здесь.
Дисульфидные связи шарнирной области антитела были выборочно уменьшены, и антитела затем инкубировали с PODS-DOTA, чтобы позволить себе DOTA-несущий иммуноконъюгировать 80% урожайности. Анализ MALDI-TOF показал степень маркировки 1,8 DOTA на антитело. Который остается последовательным по всему спектру человеческих, гуманизированных и химерных антител IgG1.
Тем не менее, те же условия производят иммуноконъюгации со степенью маркировки 1,5 для murine IgG1 антител. Из-за светочувствительность этого соединения, важно, чтобы сохранить все реакции в фольге покрытые сосуды. Это увеличит общую урожайность продукта.
Хотя этот протокол описывает синтез PODS-DOTA, аналогичная процедура может быть применена к широкому кругу потенциальных грузов, включая фторфоры, токсины и другие хелаторы. Этот метод облегчит строительство четко определенных, однородных и высококонституальных иммуноконъюгированных препаратов, которые могут быть использованы в самых различных областях. Важно помнить, что идометан добавил в шаге один из этого эксперимента может иметь вредные последствия, и поэтому должны быть использованы в дым капот.
