Наш высокой пропускной способностью анализ добавляет к доступным методам для идентификации малых молекул и их целей, которые модулируют TCR сигнализации и активации Т-клеток. Наш анализ имеет самовоспределяющийся аспект путем фильтрации токсичных соединений и выявления ингибиторов TCR сигнализации и стимуляции индуцированного апоптоза. Выявление посредников сигнализации TCR может помочь в развитии терапии иммунных заболеваний.
Мы предоставили сильный стимул для тимоцитов, полученных из TCR-поликлональных мышей. Можно использовать TCR-трансгенных мышей и стимулировать их с другими пептидными тетрамерами лиганда для более слабой стимуляции. Этот анализ включает в себя использование небольших объемов и малотомных пластин для культивирования клеток.
Это требует тщательной обработки пластин и их содержимого. Есть много соединений в библиотеке ингибиторы киназы, которые считаются опасными. Что касается безопасности, относитесь ко всем соединениям как к одинаково опасным и следуйте рекомендуемых поставщиком мерам предосторожности.
Чтобы начать лечение тимоцитов ингибиторами киназы, используйте многоканарновую пипету, чтобы добавить 40 микролитров на колодец тимоцитов в малотомерную пластину. Поставь тарелку на лед. Затем пипетка одной части ингибиторов киназы, DMSO и дексаметазона, и четыре части полного RPMI средств массовой информации в 96-хорошо пластины.
Назначить восемь скважин малообнамеренной пластины для необработанного контроля, четыре скважины для дексаметазона обработанных положительный контроль за гибелью клеток, добавив разбавленный дексаметазон в пятимимолярной концентрации, и четыре скважины для транспортных средств, обработанных контроля, добавив 0,5 микролитров разбавленной DMSO. Далее, из соответствующих скважин ингибиторной пластины, добавьте 0,5 микролитров каждого разбавленного ингибитора к пластине 96 скважин. Чтобы начать стимуляцию тимоцитов, сначала убедитесь, что анти-CD-3 и CD-28 шарики равномерно повторно приостановлено.
Затем вымойте один миллилитр бисера двумя миллилитров буфера PBS. Положите трубку на магнитный стенд, чтобы отделить бисер от супернатанта и аспирировать раствор. Затем повторно приостанавливать бисер в один миллилитр полной среды RPMI.
Добавьте 10 микролитров на колодец суспензии шарика к каждому образцу, обработанному ингибитором, четырем обработанным DMSO образцам и четырем из восьми необработанных образцов. Добавьте 10 микролитров полного RPMI к оставшимся четырем необработанным скважинам. Используйте орбитальный шейкер с микроплюей, чтобы аккуратно агитировать пластину.
Затем инкубировать тимоциты в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа окружающей среды в течение 17 до 20 часов, или на ночь. Премьер автоматизированной шайбы пластины ламинарного потока, сначала с 150 миллилитров этанола Tween раствор, затем с деионизированной водой, дополненной 1%Tween 20, и, наконец, с facS мыть буфера. В конце инкубации с помощью системы шайбы пластины, мыть пластину с FACS мыть буфер с помощью девятикратного цикла стирки.
Каждая стирка добавляет и удаляет 55 микролитров буфера мытья ламинарным потоком, что приводит к экспоненциальному разбавлению реагентов в скважинах. Чтобы окрашивать поверхностные антигены, сначала разбавляют один объем блока анти-CD-3, анти-CD-4, анти-CD-8 и анти-CD-69 антител в 100-единицных томах буфера промывки FACS. Затем повторно приостановить клетки в 25 микролитров окрашивания антител смеси.
Используйте орбитальный шейкер из микропластиров, чтобы аккуратно агитировать пластину, а затем оставить пластину на льду на 30 минут. Чтобы исправить клетки, сначала мыть пластину с 55 микролитров facS мыть буфер с помощью девяти раз цикл стирки, как описано ранее. Затем добавьте 50 микролитров буфера фиксации-империаблизации к каждой колодец.
Хорошо перемешать и инкубировать пластину на льду в течение 30 минут. После инкубации подготовьте буфер one-X perm и вымойте буфер, разбавляя 25 миллилитров предоставленного 10X запаса в 225 миллилитров ultrapure воды. Премьер пластины шайбу с одним-X буфера и мыть пластину с 55 микролитров одного-X буфера с помощью девяти раз цикл стирки, как описано ранее.
Для начала смешайте один миллилитр антитела против каспазы 3 с двумя миллилитров одного-X пермяка и вымойте буфер. Добавьте 25 микролитров на колодец смеси в фиксированные клетки. Используйте орбитальный шейкер с микроплюей, чтобы аккуратно агитировать пластину.
Оставьте тарелку на льду на час. В конце инкубации повторите шаг стирки девять раз с помощью одной завивки и вымойте буфер. Затем добавьте 25 микролитров буфера промывки FACS ко всем колодцам пластины.
Pipette вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать раствор. Наконец, перенесите смешанные образцы в микротитровые трубки. Пополнить трубки буфером промывки FACS до общего объема 200 микролитров и приступить к анализу цитометрии потока.
После анти-CD-3, CD-28 стимуляции, увеличение активации каспазы-3 и TCR downregulation наблюдались как в необработанных и DMSO макет обработанных образцов. Кроме того, в обоих стимулируемых образцах наблюдалось увеличение экспрессии CD-69. Образцы, обработанные дексаметазоном, показали увеличение активации каспазы-3 независимо от регулирования CD-69, как и ожидалось для независимого эффекта, вызывающего апоптоз, и стимуляции TCR.
Селективное нарушение явлений активации Т-клеток было показано различными ингибиторами, которые либо подавляли как активацию каспазы-3, так и до регуляции CD-69, либо препятствовали регулирования CD-69, но не ухудшали активацию каспаса-3. Были также ингибиторы, которые не нацелены на соответствующую киназу пути сигнализации TCR, и поэтому не подавляли как регуляцию CD-69, так и активацию каспаса-3. Результат экрана стауроспорина, апоптоз-положительный контроль, показал высокий уровень активации каспазы-3, как и ожидалось.
Тем не менее, результат также показал низкий уровень экспрессии CD-69, которые могут быть отнесены либо к его опосредованное ингибирование белка киназы C или его индуцированного апоптоза до CD-69 выражение. Сравнение различных протоколов анализа не показало различий в активной каспассе-3, CD-69 и окрашивание TCR отрицательного контроля, положительного контроля за гибелью клеток, управления транспортным средством и образца, обработанного ингибиторами. Стадии предварительной инкубации предназначены для облегчения использования малотомной пластины для культивирования клеток.
В рукописи также представлен стандартный протокол, зависящий от центрифуг. Потенциально интересные ингибиторы или цели могут быть проверены с использованием различных типов клеток, а также у различных видов, таких как пагоферные лимфоциты мыши или первичные клетки человека. Последующая характеристика выявленных молекул и целевых показателей может помочь улучшить понимание биологии Т-клеток и расширить возможные целевые показатели иммуномодуляции.
