Этот метод использует мульти-фотон лазерного сканирования микроскопии в сочетании с лазерной вспышки фотолиза фотоактивируемой молекулы никотина. Позволяет точно активации никотиновых холинергических рецепторов. Этот метод позволяет тонкой spatiotemporal контроль над никотиновых рецепторов агонист применения, обеспечивая мощный инструмент для изучения рецепторов функциональных моделей выражения и холинергической синаптической или передачи объема.
Перед началом процедуры используйте программируемый шкив пипетки, чтобы вытащить стеклянный микропипец диаметром от 20 до 40 микрометров. Процедите примерно один миллилитр записывающего раствора через фильтр 0,22 микрона. И повторного использования достаточно лиофилинизированного фотоактивируемого никотина в фильтрованном растворе записи, чтобы дать двухмилимоляльную окончательную концентрацию.
Заполнюте вытащил местного применения micropipette с 50 микролитров фотоактивируемого препарата, и обеспечить пипетку в держатель пипетки установлен на микроманипулятор. Подключите держатель пипетки через соответствующую длину труб с системой выброса давления, способной поддерживать применение низкого давления. И использовать микроманипулятор для маневра локального применения пипетки во внеклеточный раствор записи.
Распоитите наконечник пипетки чуть выше образца ткани мозга мыши, примерно в 50 микрометрах от клетки интереса. И кратко применить один-два фунта на квадратный дюйм давления на пипетки. Перемещение ячейки интересов должно быть минимальным и не должно быть.
После достижения стабильной цельноклеточный зажим патч, включите низкое применение на устройство выброса давления, и насытить ткани, окружающие клетку с фотоактивируемым никотином в течение одной-двух минут. Локальное приложение вводит дополнительную сложность эксперимента. Но он щадит соединения и позволяет более высокие концентрации PA-Nic, которые будут использоваться.
Для применения в ванне фотоактивируемого никотина сначала растворяют достаточно лиофилизированный препарат в объеме записывающего раствора, подходящего для непрерывной рециркуляции до 100-микромоляльной конечной концентрации. И загрузите полученную смесь в перфузионную систему. Затем начните рециркуляцию фотоактивируемого никотинового раствора со скоростью от 1,5 до 2 миллиметров в минуту, используя трубки с минимальным внутренним диаметром и общей длиной, чтобы свести к минимуму необходимый объем рециркуляции.
Во время рециркуляции, непрерывно пузырь раствор карбогена, и поддерживать температуру ванны на 32 градусов по Цельсию в условиях низкой освещенности. Ванна приложение выгоды от простоты и единообразия PA-Nic пронизывания ткани. Но он обязательно использует более низкие концентрации микромолара PA-Nic, и расходует более высокое общее количество соединений.
Для живой визуализации медиальной нейрона хабенула используйте передаваемую световую или инфракрасную дифференциальную контрастную оптику и видеокамеру для создания стабильной, цельноклеточной записи зажима. После создания конфигурации, прикрепленной к ячейкам высокого сопротивления, но перед взломом переключитесь на настройку и программное обеспечение в режим лазерного сканирования. После взлома используйте лазерное сканирование, чтобы убедиться, что представляющий интерес краситель для визуализации пассивно заполняет нейрон путем диффузии.
Позвольте красителю заполнить клеточные отсеки, по крайней мере от 20 до 30 минут, прежде чем использовать функцию живого сканирования для визуализации нейрона и подклеточного отсека интереса. Выберите параметры изображения, которые позволяют точно визуализировать функции нейронов в реальном времени, манипулируя соответствующими настройками, чтобы повлиять или изменить визуализацию дисплея, разрешение, соотношение сигнала к шуму и время приобретения изображений по мере необходимости. Для усиления контрастности сигнала откройте окно таблицы осмотра и отрегулируйте настройки пола стола и потолка.
Чтобы найти область, интересную в ткани, выберите 1X оптический зум и используйте элементы управления панорамированием. Используйте инструмент серии «Я», чтобы выбрать позицию начала и остановки, которая содержит ячейку интереса. Установите размер шага в один микрометр и выберите размер изображения, который даст изображение с высоким разрешением.
Часто 1 024 на 1024 пикселя на линию. Затем последовательно изображение нейрона в каждой плоскости, которая содержит клетку. Чтобы откалибровать лазерную стимуляцию, начните сканирование системы с помощью лазерной мощности изображения, больше минимальной, и настройте объективную направленность на тонкий слой флуоресценции красного маркера.
Выберите область в поле флуоресценции, очищенную от мусора и равномерно покрытую маркером, и откройте инструменты, калибровку и меню выравнивания, чтобы выбрать функцию неукозывной гальвокалибрации. Следуйте учебнику по ожоговым пятнам для пространственной калибровки второй пары зеркал гальванометра, выбрав 405-нанометровый лазер, мощность лазерной стимуляции 400 и продолжительность стимуляции 20 миллисекунд. Для того чтобы дать отверстия диаметром от одного до пяти микрометров в красном маркере.
Выберите обновление, чтобы стимулировать и обновить изображение после сжигания в центре пятна, и переместите круглый красный индикатор в фактическое расположение места в центре, правом центре и нижнем центре пятна, чтобы получить сетку из девяти пятен. Чтобы проверить калибровку, откройте окно точек отметки и вручную активируйте параметры стимуляции определенных пятен в новой области образца, заботясь о том, чтобы правильный файл последней калибровки был загружен в окно точек отметки. Затем нанесите тестовый импульс для проверки правильной калибровки.
Чтобы кратко изображение и найти подклеточную область интереса, выберите живое сканирование и использовать увеличить оптический зум, чтобы визуализировать любые небольшие структуры по мере необходимости. Поместите точку отметки одно пятно перекрестие непосредственно рядом с клеточной мембраны, и установить параметры фотостимуляции от одного до 50-миллисекундной продолжительности, от одного до четырех милливатт лазерной мощности, и по крайней мере одно испытание. Затем выберите точки отметки запуска, чтобы инициировать протокол точек отметки, и наблюдать за получением данных электрофизиологии в режиме реального времени.
Фотоактивируемый никотин 2PE флуоресценция одномимилолярного PA-Nic легко обнаруживается во время выброса давления из местного пипетки приложения, как попродемонстрировано. В то время как доставка основных фотохимических продуктов фотоактивируемой реакции фотолиза никотина не генерирует флуоресцентного сигнала при той же концентрации и возбудительной силе и длине волны. Демонстрация специфики результатов фотоактивируемого никотина.
Изображение фотоактивируемого никотина, применяемого к тканям мозга, как попродемонстрировано, показывает наличие препарата в пределах от 100 до 200 микрометров от местного применения пипетки. Подтверждение того, что фотоактивируемый никотин может быть эффективно доставлен в ткани мозга с помощью местного применения. Здесь показаны высококачественные изображения, в которых нейрональная морфология кажется полной, шум сведен к минимуму, а мусор не мешает интерпретации клеточной морфологии.
Эти изображения, однако, имеют более низкое качество. Из-за более низкого соотношения сигнала к фону и существенного мусора. Сопряжение двухкотонной лазерной сканирующей микроскопии медиальной хабенулы в срезах мозга с лазерным флэш-фотолизом PA-Nic, как попродемонстрировано, позволяет сверкой электрофизиологических реакций с клеточной морфологией.
Однотомный фотолиз, выполняемый с интервалом в 10 секунд, позволяет достаточное время восстановления базового тока. В то время как более короткий интервал в одну секунду приводит к постепенному увеличению текущего удерживаемого по мере поступления протокола. Предполагая, что никотин не имеет достаточно времени, чтобы рассеять от системы с более короткими интервалами.
При разработке экспериментов, использующих фотоактивируемые молекулы, важно помнить о выборе флуоресцентных индикаторов и сообщать о флуорофорах с совместимыми спектрами выбросов возбуждения. PA-Nic совместим с наиболее распространенными флюорофорами из-за своего короткого пика фотолиза длины волны. При выборе наиболее подходящего метода применения PA-Nic важно тщательно рассмотреть функциональное выражение, физиологическую активность никотиновых рецепторов в нейронах, представляющих интерес.
Квалифицированное использование этого метода позволяет тонкой spatiotemporal контроль никотина применения, что позволяет захватывающие новые возможности для изучения кинетики родной никотиновых рецепторов участия, субклеточной локализации и модуляции нейронной активности никотиновых рецепторов активации.
