Спиннинг диска TIRF микроскопии может быть полезным инструментом для изучения роли белка во время формирования цитоскелетной сети. Этот метод позволил трехмерную визуализацию быстрых клеточных подходов, которые происходят в клетке и в то же время точную локализацию молекулы флуоресценции, которые находятся на плазменной мембране. Этот метод может дать представление о таких областях исследований, как микробиология, клеточная биология, и все те отрасли, где важно изучать взаимодействие между плазменной мембраной и клеточной средой.
Этот метод может быть распространен на те живые эксперименты изображения, где важно локализовать структуры в плазменной мембране и где вы также хотите сохранить высокое разрешение оставшегося клеточного объема. Важнейшие вещи, которые нужно учитывать, это выбор правильной клеточной линии для настройки освещения TIRF и других параметров изображения и найти фокус трансфицированных клеток. Визуальная демонстрация этого протокола, безусловно, поможет избежать проблем с обработкой ячеек во время получения изображения.
За два дня до эксперимента, семена 3000 HELA или NIH 3T3 клетки в двух миллилитров полного роста среды в каждом хорошо из шести хорошо пластины клеточной культуры. На следующий день приготовьте трансфектные реагенты. Во-первых, разбавить один микрограмм RFP Livact и один микрограмм YFP Винкулин в общей сложности 200 микролитров уменьшенной среды сыворотки.
Вихрь трансфекции реагент кратко. Затем добавьте четыре микролитров смеси в 200 микролитров ДНК. Vortex реагентов снова, а затем инкубировать трансфекции смесь в течение 15 до 20 минут при комнатной температуре.
После инкубации, добавить весь трансфекции смесь капли мудрым непосредственно к клеткам. Смешайте колодцы, встряхнув тарелку, а затем поместите обратно в инкубатор. В день эксперимента подготовьте образец для живой визуализации, сначала покрывая 35-миллиметровую стеклянную нижнюю тарелку 10 микрограммом на миллилитр раствор фибронектина в PBS.
Оставьте раствор на стеклянной поверхности на 30 минут при комнатной температуре, затем удалите его и дайте блюду высохнуть. Затем разбавьте раствор мультифлуоресцентного шарика диаметром 0,1 микрона до плотности 1,8 миллиарда частиц на миллилитр в дистиллированной воде. Добавьте раствор к стеклянной поверхности с покрытием Фибронектина в течение 30-60 секунд.
Затем снимите раствор и дайте блюду высохнуть. Предварительное покрытие блюд флуоресцентными бусинами необходимо только по двум причинам, во-первых, если вы хотите найти плоскость TIRF перед посевом клеток или приобрести двухцветное изображение шарика для регистрации изображения. Теперь подготовьте антиоксидирующую среду роста, добавив раствор 0,1 молярной аскорбиновой кислоты при конечной концентрации 0,1 миллимоляра в среде роста.
Довоенная средства массовой информации, поместив его в 37 градусов по Цельсию водяной бане. Затем промыть клетки двумя миллилитров PBS и добавить 250 микролитров трипсина EDTA к каждому хорошо пластины. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию и ждать две-три минуты, пока клетки полностью отделены.
Тщательно расходуйте клетки в один миллилитр предварительно окисляемой среды роста и добавляйте их в дополнительные четыре миллилитров среды в 15 миллилитровую трубку культуры клеток. Поместите подвеску клетки со слегка открытой крышкой в инкубатор, установленный при 37 градусах Цельсия, буферив с 5%-ным углекислым газом. Для начала начните экологический контроль микроскопа для достижения стабильных условий клеточной культуры.
Затем поместите стеклянную нижнюю тарелку, содержащую один миллилитр предварительно окисляемой среды роста, в образец держателя разогретого микроскопа. Далее, в программном обеспечении для визуализации, настроить настройки приобретения на микроскопе. Установите интервал времени приобретения до 30 секунд, а продолжительность - от 60 до 90 минут.
Кроме того, активировать функцию автофокусирования на основе аппаратного автофокуса для каждой точки времени, установив значение до одного. Теперь отрегулируйте экспозицию камеры до 200 миллисекунд, уровень усиления до 500, а мощность лазера до 20% для каждого канала. Для снижения фототоксичности рекомендуется высокий уровень усиления, низкое время экспозиции и низкая мощность лазера.
Затем установите стек для вращающихся дисковых каналов до 10 микрон с интервалом 0,4 микрона, а затем установите нижнюю смещения до нуля, чтобы самая низкая плоскость была фокусной позицией автофокусировки оборудования и деактивировала стеки для каналов TIRF. Наконец, активируйте многоослойные позиции стадии функции. Это позволит за 30-секундным интервалом фиксировали до трех позиций.
Теперь найдите флуоресцентные бусины с эпифлуоресцентным освещением, активируйте один канал TIRF и установите угол освещения до значения, обозначая освещение TIRF. Затем активируйте автофокус, нажав кнопку на панели микроскопа, и отрегулируйте фокус с смещением колеса. Оказавшись в фокусе, приобрети двухцветный набор данных с использованием TIRF 488 и TIRF 561 для последующей регистрации изображений на основе бисера.
Удалите клетки из инкубатора и смешайте подвеску клетки, инвертировать закрытую трубку два-три раза. Затем нанесите один миллилитр клеток на изображение блюдо. Быстро найти двойные трансфектные клетки с низким уровнем эпифлуоресцентного освещения.
После того, как найдено, центр клетки в живой камере предварительного просмотра с помощью ярко-полевого освещения и пометить положение. Затем найдите еще одну-две точки интереса, сохраните их в списке позиций и начните сбор данных, нажав на кнопку последовательности. В начале клетки могут легко отсоединиться из-за сценического движения, поэтому лучше установить четыре-пять позиций, а затем сбросить одну или две.
Для создания гиперстака без регистрации на Фиджи сначала загрузите и сохраните предоставленный файл SD-TIRF_helper_jove. ijm в фиджийской субфолдерных макросах. Вы запустите макрос, нажав на команду меню, начиная с плагинов затем макросов и, наконец, запустить.
Если цветные каналы нуждаются в коррекции регистрации, выберите опцию и создайте новую ссылку на регистрацию на основе бисера, известную как файл ориентира. Далее импортируют данные с импортером биоформатов и выбирают гиперстах в качестве опции просмотра. Загрузите набор данных изображения, выберите ряд вращающихся дисков на первом этапе и серию TIRF на втором этапе.
На этом этапе Фиджи будет отображать данные, отсортированные по каналу и положению на этапе. Примените коррекцию регистрации к соответствующим каналам, загрузив заданный файл ориентира. Затем выберите нужный цвет таблицы для каждого вращающегося диска и канала TIRF и объединить их в один многомерный гиперстах.
Во время обработки изображений TIRF в нижнюю плоскость добавляется несколько плоскостей zed, и это число совпадает с количеством плоскостей в вращающихся дисках наборов данных. Это очень важно для визуального представления финального гиперстака. Используя установку, описанную в этом видео, были выбраны ячейки YFP и RFP-экспрессии, и их процесс адгезии наблюдался в течение 60-минутного таймлапса.
Как и ожидалось, клетки были круглой формы и только слабо приверженцев в начале с мембранными выступами зондирования окружающей среды и вступления в контакт с субстратом. Контакт клеточной матрицы быстро укрепляется при образовании так называемых зарождающихся спаек. С течением времени адгезионые комплексы увеличены и созрели до фокусных спаек.
Эти удлиненные структуры были преимущественно очевидны на периферии клетки. Это произошло от сил, которые были приложить актомиозин волокон, которые вызвали укрепление клеточных матричных спаек, а также комплектации актиновых волокон. Ячейка также сплющена в результате формирования сети актина.
Скорость приобретения зависит от следующих параметров, интервала времени, времени экспозиции, количества плоскостей zed и количества позиций. Поэтому очень важно оптимизировать эти параметры для высоких показателей приобретения. Внедрение новейшей технологии прядильного диска превратит микроскопию спиннинг-диска TIRF в новую микроскопию супер разрешения, которая позволит изображения с высокой временной скоростью.
Спиннинг дисковой микроскопии является очень мощным методом для изучения процессов, которые происходят между внутренней клетки и клеточной мембраны. Нам показали, что мы можем следить за динамикой vesicle, приобретая очень большие стеки изображений в течение нескольких секунд. Коллимированный лазерный свет опасен для глаз.
Никогда не смотрите прямо в луч и используйте меры предосторожности прибора, чтобы избежать прямого воздействия света.
