Это видео продемонстрирует простой метод для исследования нескольких генов-кандидатов в AML параллельно, используя систему Crisper-Cas9 в сочетании с цитометрией потока на основе конкурентного анализа роста. Основным преимуществом этой техники является то, что она быстрая и масштабируемая. Демонстрация процедуры будет Бо Руи Чэнь, пост документ из нашей лаборатории.
Программное обеспечение для проектирования CRISPR на основе Интернета используется для разработки четырех-шести отдельных RNAs руководства для гена интереса. Для начала заполните соответствующую информацию в полях звездочками. Затем выберите целевой геном для одного руководства РНК-дизайна.
Вставьте целевую последовательность в поле последовательности и нажмите на кнопку отправки. Для клонирования в желаемом одном руководстве РНК выражение плазмид, prepend нуклеотидов CACC в смысле глионуклеотид и AAAC к обратному бесплатный антисенсе олигонуклеотид. Premixed чувство и antisense oligonucleotides после этого приказано от компании в плите 96 наилучшим образом, обозначенной смешиванием Oligo.
Установите отдельный U-Bottom 96 хорошо пластины, помечены Аннеалирование плиты. Подготовь мастер-микс из одного микролитера полинуклеотидной киназы Т4, одного микролитера буфера перевязки ДНК 10x T4 и шести микролитров воды на аннеалятную реакцию. Добавьте 8 микролитров мастер-микса к каждому колодец Аннеалярной плиты, а затем 2 микролитров премиксового смысла и антисенс-олигонуклеотидов.
Pipette два-три раза осторожно хорошо перемешать, а затем спина пластины кратко, чтобы получить смеси на дно скважин. Используйте следующую программу annealing в машине PCR. 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, 95 градусов по Цельсию в течение двух минут и 30 секунд, а затем медленное охлаждение до 22 градусов по Цельсию со скоростью 0,1 градуса по Цельсию в секунду.
Когда annealing будет завершена, подготовить свежие 96 хорошо пластины, помечены Разбавленный Oligo Mix, путем разбавления фосфорилированных и annealed олигонуклеотидов от аннеалирования реакции один до 200 с водой. Линейность вектора экспрессии РНК-руководства путем переваривания пяти микрограммов вектора с 1,5 микролитров фермента ограничения BBS1, используя соответствующий буфер при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. Далее возьмите свежие 96 хорошо пластины помечены Лигация плиты, и добавить 20 нанограммОВ BBS1 переваривается одного руководства РНК экспрессии вектор к одному хорошо на желаемое одно руководство РНК перевязки.
К этому добавьте 2 микролитров фосфорилированных олигонуклеотидов из разбавленной пластины Oligo Mix. Добавить к каждой хорошо, один микролитер 10X T4 лигазы буфера, и один микролитер фермента T4 лигазы, и осторожно пипетки для смешивания. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение двух часов.
Примерно за 10 минут до того, как будет сделана реакция перевязки, заполните 90 микролитров химически компетентных клеток E.coli на льду. Передача 10 микролитров aliquots компетентных клеток в каждом колодец отдельного 96 хорошо пластины индивидуально. Добавьте смесь перевязки в скважины, содержащие компетентные клетки.
Пипетка вверх и вниз мягко, и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Pipette пять микролитров смеси ДНК бактерий из каждой реакции преобразования непосредственно в колодец 6 пластины хорошо, содержащий LB агар с 100 миллиграммов на миллилитр ампициллина. Добавить примерно пять-восемь стеклянных бусин к каждому хорошо, и встряхнуть 6 хорошо пластины от восьми до 10 раз круговыми движениями.
Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день, выбрать один-два одиночных колоний из каждой хорошо, со стерильным 20 микролитр пипетки отзыв, и полоса его на помечены месте на стерильных 10 сантиметров Петри блюдо, с LB агар и 100 миллиграммов на миллилитр ампициллина После полос на пластине LB, извлечь кончик в три миллилитров ампициллина среды в 14 миллилитров , отмечен соответствующим бактериальным числом клонов. Бактериальная пластина затем отправляется непосредственно для секвенирования Сэнгер.
После подтверждения последовательности клонированных одногидных РНК, очистите ДНК от соответствующей 14 миллилитровой трубки, используя комплект miniprep в соответствии с инструкциями производителя. Однонародные РНК-лентивирусные частицы производятся в формате 96 хорошо, как описано в текстовом протоколе. А вирусный супернатант сразу замораживается при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
За день до трансдукции одного направляющих РНК в клетках AML Cas9, пальто плоского дна, не ткани культуры лечение 96 хорошо пластины, с 100 миллилитров рекомбинантных человеческих фибронектин фрагмент при концентрации 10 микрограмм на миллилитр. Оберните пластину цепляться обернуть, чтобы избежать потери испарения, и оставить его на скамейке на ночь. На следующий день удалите рекомбинантный фрагмент фибронектина человека с каждой пластины из 96 хорошо.
Оттепель вирусных supernatant каждого отдельного руководства РНК при комнатной температуре. Добавьте 50 микролитров вирусного супернатанта из каждой трубки к каждой покрытой хорошо трансдукционной пластины. Оберните пластину пленкой, чтобы избежать потенциального загрязнения во время центрифугации.
Спин пластины на 1, 300 раз г при 35 градусов по Цельсию в течение 90 минут. Ближе к концу спинфекции подсчитайте высокие клетки Cas9, выражаюющие клон В3 из культуры колбы. После подсчета, спина вниз необходимое количество клеток, и повторного перерасхода в свежей среде.
После 90-минутной спинфекции используйте многоканарновую пипетку, скорректированную до 50 микролитров, чтобы медленно удалить супернатант из всех скважин, наклонив пластину. Добавьте 100 микролитров культуры клеток клона B3 к каждой хорошо медленно, сползая вниз от обода. Спин пластины на 1, 300 раз г при 35 градусов по Цельсию в течение двух минут, чтобы клетки оседают на дно.
Перенесите пластину в инкубатор культуры тканей по Цельсию на 37 градусов цельсия. На следующий день добавьте 100 микролитров свежей среды к каждому хорошо содержа одномандатным РНК-транс индуцированным клеткам, таким образом, чтобы окончательный средний объем составил 200 микролитров. Верните тарелку в инкубатор.
72 часов после трансдукции, проверить процент одного руководства РНК, содержащей BFP положительные клетки в каждой хорошо поток цитометрии. Используйте краситель жизнеспособности клеток, чтобы отметить и исключить мертвые клетки из анализа. Продолжить повторное покрытие доли клеток в новые скважины со свежей среде после каждого анализа фактов, чтобы избежать разрастание во время анализа.
Каждые два-три дня повторяйте анализ фактов, чтобы проверить относительную долю положительных ячеек BFP по сравнению с отрицательными аналогами BFP. Проанализируйте процент положительных ячеек BFP для каждой точки времени, используя программное обеспечение для анализа фактов. Ключом к успеху конкурентного анализа распространения является использование надлежащих методов gating для обеспечения того, чтобы в конечном итоге живые номера клеток являются точными.
Перетащите файлы FCS для каждого образца в программное обеспечение. Двойное нажатие на любой образец файла, и построить точку участок вперед рассеяния по сравнению с боковой рассеяния, с вперед рассеяния на х-оси, и боковой рассеяния по оси. Ворота все клетки.
Двойное нажатие на закрытые ячейки, и участок жизнеспособности пятно на y-оси по сравнению с вперед рассеяния высоты или области точка участка. Ворота жизнеспособности пятно отрицательных клеток. Двойное нажатие на закрытые живые ячейки, и участок BFP на y-оси по сравнению с вперед рассеяния на x-оси.
Ворота BFP положительные ячейки. Примените все эти ворота ко всем образцам, перетащив выбранный образец во все образцы под вкладкой группы. Нажмите на редактор таблицы, чтобы сделать таблицу анализа всех образцов.
Перетащите положительный отсчет BFP из одного образца в таблицу и нажмите на кнопку отображения в редакторе таблицы, чтобы создать пакетный отчет по всем образцам, при этом таблица отображает процент положительных ячеек BFP. Сохраните таблицу в качестве файла Excel. Эта система была использована для исследования роли генов, которые могут играть определенную роль в распространении или выживании человеческих и murine AML клеточных линий.
Ориентация на локус безопасной гавани AAVS1 с двумя отдельными однонаправленными РНК не повлияла на пролиферацию клеток MOM13 Cas9 человека В отличие от этого, когда был направлен связанный с репликацией ДНК ген RPA3, наблюдалось прогрессивное и значительное снижение доли положительных клеток BFP по сравнению с отрицательными непереведенными аналогами BFP. Аналогичным образом, эффекты одного руководства РНК ориентации Dot1l, эпигенетический регулятор, и родопсин, ген пигментации глаз, были протестированы в мыши MLL-AF9 Cas9 клеток. Одно руководство РНК ориентации Dot1l, показали резкое и постепенное снижение конкурентоспособности распространения в отличие от одного руководства РНК ориентации Родопсин.
Эти результаты демонстрируют уязвимость MLL-AF9, выражаюющего массовые клетки лейкемии к истощению Dot1l, подтверждая ранее опубликованные результаты. Предполагая, от четырех до шести руководства РНК на ген, этот метод хорошо подходит для использования для тестирования по крайней мере от 16 до 24 генов параллельно, и он также может быть применен для тестирования генных зависимостей в любой линии раковых клеток. В случае большего числа генов, таких как весь молекулярный путь, который должен быть протестирован в клетках AML, бассейн CRISPR-Cas9 на основе экранов будет более полезным.
