Это первый документ, который рассматривает технические проблемы в секвенировании малых РНК, полученных из внеклеточных пузырьков из клеток. Образцы NGS требуют строгой подготовки и контроля качества. Из-за характера EVs, процесс КК образцов EV отклоняется от нормы.
Преимуществом этого протокола является КК шаги в этом для впервые пользователей. Демонстрацией процедуры будет Junyi Su, научный сотрудник из моей лаборатории. Для начала пластины человеческих мезенхимальных стволовых клеток на 2000 клеток на квадратный сантиметр в свежих средствах массовой информации MSC в пяти колбы T175.
Затем расти клетки при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды и заменить средства массовой информации каждые два-три дня, пока пять колб 90% слияние клеток получены. Затем, мыть клетки три раза с 20 миллилитров PBS на колбу. Добавьте 20 миллилитров средств массовой информации коллекции EV в каждую колбу.
И инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды в течение 48 часов. Соберите средства массовой информации и центрифуга его в течение 10 минут при 300 г и четыре градуса по Цельсию. Затем соберите супернатант, и центрифуга средств массовой информации в течение 20 минут при 2000 г и четыре градуса по Цельсию.
Соберите супернатант снова, и центрифуга средств массовой информации в течение 30 минут при 15, 500 г и четыре градуса по Цельсию. Соберите супернатант в последний раз. Затем перенесите средства массовой информации в ультрацентрифуговые трубки.
Здесь используется ротор с фиксированным углом 60Ti, и гранулы будут закреплены на боковой стороне трубки. Отметйте сторону крышки, где ожидается гранулы, и нарисуйте круг на стороне трубки, где гранулы, как ожидается. И гранулы exRNAs в течение 90 минут при 100 000 г и 4 градуса по Цельсию.
После окончательной центрифугации удалите супернатант. Используйте небольшие кусочки абсорбющей бумаги, чтобы высушить внутреннюю часть трубки, не касаясь нижней части трубки. А потом инвертировать трубку на абсорбентной бумаге.
Чтобы повторно использовать гранулы, добавьте 200 микролитров PBS в каждую трубку и вихрем трубки в течение 30 секунд. Пипетт вверх и вниз 20 раз. Затем оцените внеклеточные пузырьки и другие биомолекулы с помощью анализа слежения за наночастицами.
И хранить гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию до дальнейших экспериментов. После оттаивания образцов используйте комплект изоляции РНК для извлечения РНК в соответствии с протоколом производителя. Elute РНК из колонны, представленной в комплекте изоляции РНК в 100 микролитров без РНАС воды.
Чтобы сконцентрировать РНК на этаноловом осадке, добавьте один микролитер гликогена, 10 микролитров двухмолярного рН-5,5 ацетата натрия и 250 микролитров предварительно охлажденного этанола в 100 микролитров очищенной РНК. Затем инкубировать образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию на ночь, чтобы вызвать РНК. Чтобы гранулировать РНК, центрифугу в течение 20 минут при 16 000 г и 4 градусах Цельсия.
Затем удалите супернатант и вымойте гранулы РНК одним миллилитром 75%этанола. Центрифуга снова в течение пяти минут при 16 000 г и 4 градуса по Цельсию, чтобы гранулировать РНК. Снимите этанол и оставьте крышку РНК-трубки открытой в течение пяти-десяти минут, чтобы высушить РНК-гранулы.
Повторное использование РНК гранул в семи микролитерах воды, свободной от РНК, и использование чип-капиллярной электрофорезной машины для обнаружения качества и концентрации РНК. Чтобы начать строительство библиотеки, пипетка пять микролитров РНК в предварительно охлажденных 0,2-миллилитровый ПЦР трубки. Далее разбавляют 3'адаптеры в безрновой воде при соотношении 1 к 10 объема.
Добавьте 0,5 микролитров разбавленного адаптера в РНК-трубку и пипетку смесь вверх и вниз восемь раз. Центрифуга кратко собрать всю жидкость в нижней части трубки. Инкубировать смесь РНК-адаптера при 70 градусах по Цельсию в течение двух минут в разогретом тепловом циклере.
А затем поместите образец обратно на охлажденный блок. Затем добавьте в смесь РНК-адаптера один микролитер буфера перевязки, 0,5 микролитров ингибитора РНКазы и 0,5 микролитера РНК-лигазы Т4. Pipette вверх и вниз восемь раз, и центрифуга кратко.
Затем инкубировать трубку при 28 градусах по Цельсию в течение одного часа в разогретом тепловом циклере. Затем добавьте 0,5 микролитров стоп-раствора в образец трубки, при этом трубка останется в тепловом циклере. Pipette вверх и вниз восемь раз, и продолжают инкубировать при 28 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
Разбавить 5'адаптеров в RNAse-свободной воды на один-к-10 объем соотношение. Добавьте 0,5 микролитров разбавленного адаптера в отдельную 0,2-миллилитровую ПЦР-трубку. Нагрейте 5'адаптер при температуре 70 градусов по Цельсию в течение двух минут.
А затем поместите образец на охлажденный блок. Добавьте 0,5 микролитров 10-наномольного АТФ и 0,5 микролитров РНК-лигазы T4 в трубку 5'adapter. Пипетт вверх и вниз восемь раз.
И центрифуга кратко собрать все жидкости в дно. Затем добавьте в образец РНК 1,5 микролитров смеси 5'adapter. Pipette восемь раз очень мягко, и инкубировать образец при 28 градусов по Цельсию в течение одного часа.
Чтобы получить cDNA, разбавить обратную транскриптазу грунтовка в RNAse свободной воды на один-к-10 тома соотношение. Добавьте 0,5 микролитров разбавленной грунтовки в образец РНК, пипетку восемь раз очень осторожно и центрифугу ненадолго. Затем инкубировать РНК и грунтовку смесь при 70 градусах по Цельсию в течение двух минут в разогретом тепловом циклере.
А затем поместите образец на охлажденный блок. Затем добавьте в образец пробную трубку один микролитр 5X First Strand Buffer, 0,5 микролитров смеси DNTP 12,5 миллимолярной смеси DNTP, 0,5 микролитров 100-миллимолярной DTT, 0,5 микролитров ингибитора РНАЗ и 0,5 микролитров обратной транскриптазы. Пипетт восемь раз очень мягко.
И центрифуга кратко. Инкубировать образец при 50 градусах по Цельсию в течение одного часа в разогретом тепловом циклере. Далее добавьте 4,25 микролитров ультрачистой воды, 12,5 микролитров смеси ПЦР, один микролитр грунтовки индекса и один микролитр универсальной грунтовки в образец кДНК.
Pipette вверх и вниз восемь раз, и центрифуга кратко. Наконец, поместите образец в тепловой циклер и установите циклер в соответствии с рукописью. Чтобы очистить библиотеку РНК, используйте автоматический фракционный размер ДНК, чтобы очистить полосы между 140 и 160 базовыми парами.
Запустите извлеченную библиотеку на основе колонки комплект очистки ПЦР, и elute библиотеки в 10 микролитров RNAse свободной воды. Чтобы проверить размер библиотеки, загрузите один микролитер очищенной библиотеки на чип ДНК и следуйте протоколу производителя. Для количественной оценки концентрации библиотеки сначала разбавляют один микролитр очищенной библиотеки в 10-миллимолярном рН-8.0 Tris-Hcl с 0,05%полисорбатом 20 при соотношении 1 к 1000 томов.
Затем запустите КККР, используя стандарты ДНК комплекта количественной оценки коммерческой библиотеки. Наконец, пул равное количество библиотек в соответствии с требованиями машины секвенирования и последовательности в системе секвенирования с высокой пропускной способностью. Электроферограмма внеклеточных РНК включала широкий спектр РНК.
В отличие от этого, клеточная РНК показала очень отчетливые пики, соответствующие 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA и 28SrRNA. В результате качество обеих библиотек было высоким и сопоставимым. Распределение длины обеих библиотек показало один пик в 22 нуклеотидов, с коррелирует с микроРНК.
В отличие от этого, библиотеки из внеклеточных РНК были более неоднородными и содержали еще два пика, которые коррелируют с тРНК, половинками и фрагментами, или пирнами. 65% считывай с клеточной РНК были отображены на микроРНК человека, и на каждую из других малых РНК приходится небольшая часть картографических считывай. В отличие от этого, только 8% внеклеточных РНК соответствовали микроРНК человека.
Наиболее распространенной небольшой РНК, к которой читает отображаются были tRNAs, и непревзойденный читает позже соответствует бактериальных последовательностей. Сравнение с геномом крупного рогатого скота показало, что FBS не является источником загрязнения. Таким образом, внеклеточные РНК обладают нетипичным профилем по сравнению с нормальной клеточной РНК.
Подготовка библиотеки является важной частью этого протокола. Смешивание должно быть сделано очень осторожно, чтобы избежать пузырьков от формирования. Этот метод также может быть использован для исследования профиля exRNAs из других видов клеток, что помогает изучить функцию exRNAs.
