Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигеномики, демонстрируя, как разработать и внедрить инструмент на основе секвенирования для оценки влияния экологических факторов на метилирование ДНК. Основным преимуществом этого метода является то, что он может обеспечить более всеобъемлющий и количественный метод оценки уровней метилирования ДНК по сравнению с платформами на основе массива. Последствия этого метода распространяются на выявление изменений метилирования ДНК из-за различных типов физиологических процессов в любом организме, чьи данные последовательности доступны.
Хотя этот метод может дать представление о влиянии стресса на метилирование ДНК, он также может быть применен к другим факторам окружающей среды или физиологических условий, таких как воздействие экологических токсикантов в диете с высоким содержанием жира и условиях, таких как диабет и сердечно-сосудистые заболевания. После стрижки ДНК и проверки размера с помощью биоанализера, добавьте 180 микролитров ДНК-связывающих магнитных бусин к каждому образцу и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Пеллет бисер на магнитной пластине, и удалить супернатант.
Повторное потребление гранул в 200 микролитров 70% этанола. Затем используйте магнитную пластину, чтобы гранулы бисера, и удалить как можно больше этанола, как это возможно. Высушите бисер в тепловом блоке при температуре 37 градусов по Цельсию в течение трех-пяти минут.
Затем, повторное течение гранулы в 44 микролитров нуклеазы свободной воды, и собрать около 42 микролитров супернатанта. После перевязки адаптеров и проверки перевязки с помощью биоанализа, перенесите образцы в низкоуглеродные микроцентрифугные трубки. Затем используйте концентратор с подогревом вакуума, чтобы уменьшить объем выборки ниже 3,4 микролитров.
После этого добавьте в каждый образец 5,6 микролитров метил-сек блока Mix и инкубировать их в тепловой циклер. Подготовьтесь к гибридизации библиотеки захвата в соответствии с текстовым протоколом. Затем добавьте 20 микролитров capture Library Hybridization Mix к каждому образцу и инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение 16 часов.
Ближе к концу инкубационого периода подготовьте стрептавидин магнитные бусы, добавив 50 микролитров стрептавидина магнитных бусин на образец в новую восьми-хорошо полоса трубки. Вымойте бисер с 200 микролитров метил-Seq Связывание буфера. Поместите трубку полосы на магнитную пластину, и удалить супернатант из бисера.
Затем, повторного использования бисера в 200 микролитров метил-Seq Связывание буфера. Добавьте образцы в промытые бусины стрептавидина и инкубировать их при комнатной температуре в течение 30 минут на вращающемся миксере. В то время как образцы смешиваются, aliquot 200 микролитров метил-Seq Wash Buffer Two в тройной скважины 96-хорошо пластины и предварительно теплой до 65 градусов по Цельсию.
После инкубации образцов гранулируют магнитные бусины магнитной пластиной и удаляют супернатант. Затем, resuspend шарики в 200 микролитров метил-Seq Мыть Buffer One. Инкубировать бисер в течение 15 минут при комнатной температуре, и использовать магнитную пластину, чтобы удалить супернатант.
После этого, resuspend шарик гранулы в 200 микролитров предварительно разогретой мыть буфера два. Затем инкубировать бисер в тепловой циклер, прежде чем использовать магнитную пластину для гранулы бисера. Добавьте 20 микролитров метил-сек Elution Buffer в вымытые бусины и инкубировать их при комнатной температуре в течение 20 минут.
Используйте магнитную пластину, чтобы гранулы бисера, и передать supernatant в новую трубку полосы. Во-первых, добавьте 130 микролитров реагента преобразования бисульфита в ранее собранный супернатант. Разделите 150-микролитровые реакции поровну на две скважины.
Затем инкубировать реакции в тепловой циклер. Используйте 600 микролитров Binding Buffer, чтобы связать образцы с спин-столбцами и промыть столбцы 100 микролитров Wash Buffer. Затем центрифуга колонны, и отказаться от потока через.
После этого добавьте в столбцы 200 микролитров буфера desulphonation. Инкубировать колонны в течение 15-20 минут при комнатной температуре. Вымойте колонны дважды с 200 микролитров Wash Buffer.
Затем добавьте в столбец 10 микролитров Elution Buffer. Инкубировать при комнатной температуре и центрифуге. Подготовь мастер-микс реакции ПЦР в соответствии с текстовым протоколом.
Затем добавьте 82 микролитров мастер-микста к каждому образцу и инкубировать образцы в тепловой циклер. Во-первых, подготовить PCR Master Mix Two на льду в соответствии с текстовым протоколом. Затем к каждому образцу добавьте 25,5 микролитров ПЦР Master Mix Two и пять микролитров коммерческих индексных грунтовок и инкубировать образцы в тепловой циклер.
Оцените концентрацию ДНК образцов с высокочувствительностью реагентов обнаружения ДНК на биоанализе. Библиотеки Methyl-Seq затем представлены для секвенирования на секвенсоре следующего поколения. После преобразования бисульфита и усиления ПЦР образцов проверки, подготовить мастер смесь с связыванием буфера, воды и стрептавидина покрытием сефхарозы.
Затем добавьте 75 микролитров мастер-микста и пять микролитров вложенного продукта ПЦР в пластину 96-колодец и встряхните тарелку на шейкере тарелки в течение 15-60 минут. В то время как пластина трясется, добавьте 12 микролитров грунтовки в колодцы пирозеккунтной анализной пластины. После встряхивания поместите вакуумный инструмент в корыто, наполненное водой, затем поместите инструмент в тарелку с связывающими реакциями.
Затем погрузите вакуумный инструмент в полуполные желоба, содержащие 70% этанола, гидроксида натрия и буфера Трис-ацетата. Отключите вакуум, и поместите вакуумный инструмент в HS pyrosequencing анализ пластины для передачи бисера. Поместите тарелку на тепловой блок и инкубировать при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух минут.
Наконец, дайте пластине остыть в течение пяти минут до начала программы пиро. В этом протоколе, анализ библиотек Methyl-Seq обеспечил выстроенный в ряд список дифференциально метилированных зон, или DMRs, между подчеркнутыми и unstressed животными и графическим графиком DMRs. Проверка через bisulfite pyrosequencing показала что подчеркнутые животные все exhibited более высокие уровни метилирования через все CpGs чем unstressed животные.
Уровни метилирования в CpG 10 также были сопоставлены со средними трехнедельных уровнями КОРТ для каждого животного. Полученные результаты свидетельствуют о том, что существует скромная корреляция между данными эндокринной системы и метилирования. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы сравнить увеличение среднего размера ДНК между ДНК стрижки и адаптер перевязки шаги и обеспечить достаточное количество библиотеки до секвенирования.
Следуя этой процедуре, другие аналогичные подходы могут быть реализованы для того, чтобы ответить на новые вопросы, такие как воздействие экологических токсикантов на крысиную нейроразвитие. После своего развития, этот метод предоставил средства для исследователей в области эпигенетики для изучения генома всей изменения метилирования ДНК в любой не-модели или модели организмов, где геномные последовательности доступны. Не забывайте, что работа с чувствительными к температуре ферментами требует хранения на льду во время использования и хранения в морозильной камере минус 20 градусов.
РНК-бусины, используемые для улавливания цели, требуют оттаивания и хранения на льду при использовании и длительного хранения в морозильной камере минус 80 градусов.
