Этот метод позволяет быстро определить, содержат ли образцы вирус Зика. Это полезно для беременных женщин, пар, пытающихся забеременеть, или наблюдения за местными популяциями комаров, которые находятся в опасности заражения вирусом Зика. Основным преимуществом этой техники является то, что она быстрая, легкая, не требует дорогостоящего оборудования, а может быть выполнена без шага изоляции РНК.
Последствия этого метода распространяются на диагностику инфекции Зика, поскольку инфекция во время беременности связана с выкидышем, мертворождением и другими тяжелыми врожденными неврологическими врожденными дефектами. Хотя этот метод может дать представление о вирусе Зика, он также может быть применен к другим инфекционным заболеваниям, таким как денге, чикунгунья или вирус Западного Нила с помощью специфических для вируса праймеров. Для начала, восстановить каждый RT-LAMP грунтовки в молекулярном классе воды до окончательной концентрации 100 микромоляров.
Кратко вихрь грунтовка решение для обеспечения решения является однородным. Центрифуга в течение примерно пяти секунд на максимальной скорости, чтобы собрать грунтовки решения. Затем подготовьте 10x RT-LAMP грунтовка смесь, как указано в таблице два протокола технологий.
Vortex кратко, чтобы обеспечить однородность. И центрифуга кратко на максимальной скорости, чтобы избежать каких-либо потерь. Храните грунтовки при температуре минус 20 градусов по Цельсию, между использованиями, избегая любых циклов замораживания-оттепели.
Для образцов мочи человека, использовать либо свежую мочу, замороженную мочу или мочу в консерванте. Оттепель любые замороженные образцы на льду перед использованием. Образцы сыворотки человека должны быть либо свежими, либо замороженными, в то время как зараженные клеточные линии ЗИКВ должны содержать либо условные средства массовой информации, либо лизаты клеток.
Наконец, для комаров Aedes aegypti используйте целые туши, как свежие, так и замороженные. Оттепель любых замороженных туш комаров на льду. Поместите отдельного комара в 100 микролитров PBS.
Использование P10 пипетки отзыв раздавить комаров 10 раз, и гомогенизировать его, чтобы создать сырой комаров лизировать. Кратко центрифуга сырой лизировать гранулы любого мусора и использовать супернатант для вниз по течению RT-LAMP анализа. Для начала подготовьтесь к реакции смеси RT-LAMP на льду для каждого грунтовщика, который будет использоваться, как наброски по таблице три в протоколе технологий.
Vortex каждый образец, чтобы убедиться, что он хорошо смешивается. Затем кратко спина их вниз, чтобы предотвратить потерю объема. Для каждой реакции пипетки 23,0 микролитров мастера RT-LAMP смешиваются в 200 микролитровую ПЦР-трубку.
Затем добавьте два микролитров образца, чтобы довести общий объем до 25,0 микролитров. Используйте молекулярную воду класса для отрицательного контроля, и убедитесь, что включить положительный контроль. По желанию включите реакцию контроля специфики связанного с ним арбовируса, такого как вирус денге, как указано в протоколе технологий.
Используя тепловой блок, водяную баню или термоциклер, нагревайте образцы при температуре 61 градус по Цельсию в течение 30 минут. После этого увеличьте температуру до 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы нагреть деактивазу полимеразы. Выполните анализ RT-LAMP в отдельном замкнутом пространстве.
Разбавить флуоресцентной нуклеиновой кислоты красителя от одного до десяти в буфере TAE. Добавьте два микорлита раствора флуоресцентной нуклеиновой кислоты к 12 микорлитам реакции RT-LAMP. Оцените реакции RT-LAMP визуально, ищя наличие изменения цвета.
Дополнительно используйте камеру для съемки реакций RT-LAMP на белом фоне. Затем поместите образцы под 302 нанометровый ультрафиолетовый свет, чтобы подтвердить наличие продуктов RT-LAMP при флуоресценции. Используйте камеру, чтобы сфотографировать результат.
Для начала выполнения электрофорез залить 2%agarose гель в 1x TAE буфер с нуклеиновой кислоты пятно для визуализации. Добавьте пять микролитров лестницы ДНК в первую полосу для сравнения молекулярных весов. Для каждой реакции RT-LAMP смешайте 13 микролитров реакционной смеси RT-LAMP с двумя микролитров красителя для загрузки ДНК.
Загрузите эту 15 микролитровую смесь. Вы запустите гель на 90 вольт в течение 90 минут или до тех пор, пока полосы разделены. Изображение с ультрафиолетовым светом 302 нанометров.
После завершения, распоряжаться RT-LAMP реакций в двойных запечатанных мешках. В этом исследовании используются три различных метода для анализа реакций RT-LAMP. При использовании флуоресцентной нуклеиновой кислоты краситель положительные реакции становятся желто-зелеными по цвету, в то время как негативные реакции появляются оранжевые.
Этот краситель также приводит к флуоресцентный сигнал, когда образцы возбуждаются ультрафиолетовым светом. Наконец, rt-LAMP реакции могут быть запущены на агарозный гель. Положительные реакции RT-LAMP будут иметь полосу картины, в то время как негативные реакции не будут иметь полос ДНК.
Эти методы используются для демонстрации специфики реакции ЗИКВ РТ-ЛАМП. Только молекулярный контроль ЗИКВ имеет положительную реакцию RT-LAMP. Кроме того, в то время как ЗИКВ обнаруживается как в моче, так и в сыворотке крови пациента с известной инфекцией ЗИКА, он не наблюдается у пациентов с аимптомическим контролем без инфекции ЗИКВ.
Образцы затем проверяются на 18S rRNA человека. Только образцы, взятые у пациентов, как видно, положительные для 18S rRNA. Образцы комаров могут быть аналогичным образом протестированы на ЗИКВ или контроль качества RT-LAMP AEDAE.
Только положительный молекулярный контроль для ЗИКВ и комаров, инфицированных ЗИКВ, как видно, положительный для ЗИКВ. Однако все комары являются положительными для AEDAE по RT-LAMP. После освоения, этот метод может быть сделано в возрасте до 30 минут, если она выполняется должным образом.
Важно помнить, что реакции RT-LAMP подвержены ложноположимым реакциям. Профилактические шаги включают использование термолабильной гликозилазы ДНК uracil в реакциях, использование бокового рабочего процесса, выполнение анализа в отдельном пространстве, и сокращение времени после усиления трубки открыты. Следуя этой процедуре, в выборке могут быть выполнены и другие методы, такие как ПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, сколько копий вируса или других целей.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как использовать RT-LAMP для обнаружения вируса Зика и целевого контроля в моче человека и сыворотки, а также комаров. Не забывайте, что работа с вирусом Зика и пятна нуклеиновой кислоты может быть чрезвычайно опасным, и меры предосторожности, такие как ношение перчаток всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры. Учитывая связь вирусной инфекции Зика с врожденными аномалиями, беременные женщины, пытаюсь забеременеть, или партнеры этих женщин должны значительно свести к минимуму лабораторное воздействие вируса Зика.
