Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хронического лимфоцитаного лейкоза, такие как точный прогноз пациентов. Основным преимуществом этой техники является то, что она проста, быстра и очень точна. Последствия этого метода распространяются на надежное прогнозирование, особенно сертификации риска у пациентов с хроническим лимфоцитарный лейкоз, потому что точное прогнозирование может позже определить терапевтическое управление болезнью.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, такие как выбор продукта PCR и дайджест типов последовательности трудно узнать, потому что они требуют как точности, так и опыта. Чтобы начать эту процедуру, добавьте 200 микролитров ЭДТА в 50 миллилитров стерильной трубки сбора. Добавить 20 миллилитров периферической крови и 15 миллилитров RPMI среды в трубку и пипетку вверх и вниз два-три раза, чтобы смешать.
Затем добавьте 15 миллилитров градиентной среды плотности в новую трубку сбора 50 миллилитров. Медленно слой периферического раствора крови на плотность градиента среды, убедившись, что он не нарушает градиента. Центрифуга при 800 раз G в течение 20 минут с центрифугой тормоза.
Затем используйте стерильную трубу Pasteur для сбора моноядерного клеточного кольца, которое образовалось между верхним слоем плазменной тромбоцитов и средним слоем градиента плотности, и перенесите его в новую стерильную трубку сбора 15 миллилитров. Добавить RPMI среды таким образом, что окончательный объем составляет 12 миллилитров и пипетки раствор вверх и вниз, чтобы смешать. Центрифуга при 800 раз G в течение восьми минут.
Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клеточные гранулы 10 миллилитров среды RPMI. Центрифуга снова на 750 раз G в течение восьми минут. После этого отбросьте супернатант и растворите клеточные гранулы в одном миллилитре PBS.
Используя новую пластину Бауэра, сформирует количество клеток, смешивая 20 микролитров образца и 80 микролитров раствора от одного до 10 турок. Если обработка образца не запланирована на тот же день, центрифуга образца в 750 раз G в течение восьми минут. Откажитесь от супернатанта и храните клеточные гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Во-первых, подготовить грунтовку смесь с использованием равномерных количествах каждой подгруппы грунтовка для обеспечения беспристрастного усиления. Смешайте реагенты ПЦР, перечисленные во второй таблице текстового протокола. Добавьте 0,5 микролитров полимеразы TAP в трубку ПЦР, содержащую смешанные реагенты ПЦР.
Затем добавьте либо 100 нанограммов гДНА, либо два микролитров кДНА. Вы запустите тепловой протокол ПЦР, как описано в таблице 3 текстового протокола. После этого проверьте продукцию PCR примерно 500 базовых пар при использовании литровых грунтовок IGHV или 350 базовых пар при использовании смеси грунтовки IGHPFR1.
Для начала очистки продукта ПЦР загрузите общий объем продукта ПЦР на трехпроцентный низкоплавильный агарозный гель. Разрешить PCR продукты для запуска на гель, пока они не отделяются от фона. Акциз резких видных ПЦР полос, а затем очистить и elute их.
При обнаружении двух перестановок обе полосы должны быть вырезаны и секвенированы отдельно. Для выполнения очистки экзо-сока следуйте инструкциям производителя относительно конкретных объемов использования. Аккуратно вихрь каждый образец, чтобы смешать и инкубировать их на блок ПЦР при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
Инактивировать ферменты, нагревая их до 85 градусов по Цельсию в течение 15 минут. После этого загрузите небольшое количество продуктов ПЦР на трехпроцентный агарозный гель, чтобы оценить чистоту продукта. Последним контрольно-пропускным пунктом перед секвенированием является определение клональности выборки с помощью анализа фрагментов.
Чтобы начать анализировать последовательность, запустите соответствующее программное обеспечение. Укажите виды, такие как homo sapiens, и тип рецептора или локус. Пейс последовательности, которые будут проанализированы в формате fasta и в том числе идентификаторы в области текста в пакетах до 50 последовательностей за запуск.
Затем выберите один из следующих трех вариантов отображения результатов. Подробное представление: выберите этот вариант для того, чтобы получить результаты для каждой последовательности в отдельности. Представление синтеза: выберите эту опцию для составления сводной таблицы, заказанной геном IGHV и именем аллеля или порядком ввода последовательности.
Эта опция также обеспечивает выравнивание последовательностей, которые в любой представленной партии присваиваются одному и тому же гену IGHV и аллеле, и, наконец, файлу Excel. Выберите эту опцию, чтобы предоставить все выходные файлы в качестве электронных таблиц, объединенных в один файл. Только использование литровых грунтовок IGHV позволяет обеспечить усиление всей длины перестроенного IGHV, что позволяет определить истинную нагрузку HSM.
Ожидаемый продукт PCR составляет около 500 базовых пар. В редких случаях, когда IGHV литровые грунтовки не могут усилить клонотипик IG перестановки, IGHBFR1 грунтовки могут быть использованы. Ожидаемый продукт PCR составляет около 350 базовых пар.
Полученные последовательности затем анализируются с помощью инструмента IMG TV Квест. В первой строке таблицы результатов говорится о функциональности последовательности, поскольку измененная IG последовательность может быть продуктивной или непродуктивной. Перестановка гена IGH непродуктивна, это стоп-кодоны присутствуют в регионе VDJ и/или если перестановка находится вне кадра из-за вставок/удалений.
Важно отметить, что следует дополнительно анализировать только продуктивные и, следовательно, функциональные перестановки. При использовании параметров IMG TV Квест по умолчанию, вставки и удаления не обнаруживаются автоматически, однако сильные признаки того, что последовательность может нести такие изменения предоставляются инструментом и предупреждение появляется ниже таблицы резюме результата. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы посадить продукты ПЦР на гель достаточно долго, так что клональная связь может быть дискриминирована с поликлонального фона.
После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области хронического лимфоцитического лейкоза иммуногенетики для изучения прогностический эффект статуса соматической эпимутации у пациентов. Не забывайте, что работа с бромистым этилием может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как работа под капотом во все времена, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
