Этот протокол требует использования одного градиента плотности, что делает его значительно менее трудоемким и более рентабельным по сравнению с более сложными традиционными методами изоляции островка. Основным преимуществом этого протокола является то, что фермент доставляется непосредственно в поджелудочную железу, что приводит к повышенному пищеварению тканей и повышению урожайности островка. Начните с лентой конечностей мыши в положении на спине и распыления тела с 70% этанола.
Используя миппы из стекловолокна и изогнутые хирургические ножницы, сделайте горизонтальный разрез брюшной кожи примерно на три сантиметра и откройте кожу, чтобы разоблачить брюшную стенку. Сделайте три-четыре сантиметра вертикального разреза на брюшной полости, чтобы полностью разоблачить поджелудочной железы и поместить мышь под рассечение микроскопа. Нажмите долей печени выше подвергать желчный проток, который появляется как бледно-розовая трубка и осторожно переместить кишечник из правой поясничной и подвздошной области справа от брюшной полости подвергать желчного протока и печеночной артерии.
Используйте микро серрефины Шварца, чтобы тщательно зажать общий желчный проток как можно ближе к печени и определить ампулу Ватер, которая находится на двенадцатиперстной сосой и формируется союзом протока поджелудочной железы и общего желчного протока. Используя микро-типсы Adson, чтобы вытащить общий желчный проток учил, вставьте 30 калибровочных поул-дюймовый иглы прилагается к три миллилитров шприца, содержащего три миллилитров свежеприготовленного раствора коллагеназы P в ампулу Vater толкая иглу в проток параллельно сосуду около четверти длины судна. После того, как игла на месте, стабилизировать иглу с микро Adson типсов и медленно и неуклонно вводить три миллилитров коллагеназы P раствор в проток.
Инъекция считается успешной, если головы, шеи, тела и хвоста области поджелудочной железы полностью завышены. Правильный вход в ампулу и канюляцию общего желчного протока имеют решающее значение для успешного сбора пищи. Пирсинг протоковые стенки снижает эффективность изоляции.
Используя изогнутые и микро-типсы Adson, тщательно вытяните надутую поджелудочную железу, начиная с селезенки и продолжая к желудку и вдоль двенадцатиперстной степени. Затем поместите поджелудочную железу в 50 миллилитровую трубку пищеварения, содержащую три миллилитров раствора ледяной коллагеназы P. Для сбора островков, сначала используйте тонкие хирургические ножницы, чтобы нарезать поджелудочной железы в течение трех-пяти секунд, прежде чем поместить трубку в 37 градусов по Цельсию водяной бане на 100 до 120 вращений в минуту в течение 12 до 13 минут.
В конце инкубации, осторожно встряхните трубку в течение 30 секунд, чтобы нарушить ткани, пока решение является однородным, как это подтверждается тонкой песчано-подобной частицы ткани поджелудочной железы. Как только ткань переваривается, поместите трубку на лед и добавьте 40 миллилитров ледяного стоп-раствора, чтобы прекратить энзиматические реакции. После мягкого нарушения гранулы, спина вниз переваренной ткани в размахивая центрифуги ведро следуют две центрифуги с 20 миллилитров свежего раствора остановки на стирку.
После последней стирки, повторно гранулы в 40 миллилитров ледяной HBSS для трех дополнительных моет, resuspending гранулы в пять миллилитров градиентной раствор плотности комнатной температуры после последней стирки. Vortex трубки кратко на низкой скорости, пока решение гомогенизированы, прежде чем добавить еще пять миллилитров градиента плотности комнатной температуры в трубку. Теперь используйте 10 миллилитров пипетки мягко и медленно добавить 10 миллилитров комнатной температуры HBSS в трубку в капле мудрым образом, чтобы образование градиента и использовать размахивая центрифуги ведро, чтобы изолировать популяции клеток по плотности градиента разделения.
В конце центрифугации используйте 10-миллилитровую пипету, предварительно влажную с холодным HBSS, чтобы собрать от 5 до 10 миллилитров островка между градиентом плотности и HBSS. Перенесите островки в новую 50-миллилитровую трубку, содержащую 20 миллилитров свежего ледяного HBSS и соберите клетки путем центрифугирования в размахивая центрифуге ведра. Тщательно аспирировать все, кроме последних трех миллилитров супернатанта, не нарушая гранулы и мыть островки по крайней мере еще три раза с 20 миллилитров свежих HBSS за стирку.
После последней стирки замените супернатант четырьмя миллилитров 37 градусов по Цельсию RMPI 1640 среднего и аккуратно закружить трубку, чтобы выбить гранулы. Немедленно налейте островки в 100-миллиметровую чашку Петри и вымойте трубку пятью миллилитров свежей RPMI 1640 среды, чтобы собрать оставшиеся островки объединения мыть с другими островками. Затем используйте рассечение микроскопа и 20 микролитр пипетки отзыв, чтобы выбрать здоровые сферические или продолговатые золотисто-коричневые островки с гладкой поверхностью из чашки Петри для передачи в новую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров полной RPMI 1640 среды.
Когда все островки были собраны, поместите островки в стерильный инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа во влажном воздухе на ночь. Хорошие здоровые островки, как представляется, имеют гладкую круглую форму в то время как плохие поврежденные островки обладают шероховатости. Непереваренная экзокринная ткань полупрозрачна по внешнему виду и демонстрирует неправильную форму.
Правильная каннуляция и распределение фермента коллагеназы P может быть подтверждено инфляцией splenic части поджелудочной железы. Ночная инкубация в низкотекотных средствах массовой информации может премьер островки для глюкозы стимулировали секреции инсулина анализ на следующий день позволяет понять секреции инсулина способность островков.
