Ферментативная модификация и проточная цитометрия оценки белков, отображаемых на поверхности дрожжей

Здесь мы представляем протокол использования поверхностных субстратов дрожжей для анализов ферментативной модификации. Платформа была продемонстрирована с использованием анализа активности дефосфорилирования тирозинфосфатазы SHP-2 в отношении одного из ее субстратов в качестве репрезентативного анализа ферментативной модификации.

Поверхностный дисплей дрожжей — это стратегия связывания генотипа и фенотипа, которая обеспечивает высокопроизводительный скрининг функции белка. Традиционно, отображение поверхности дрожжей применялось для эволюции новых связывающих белков, а проточная цитометрия использовалась для оценки и сортировки по уровням прочности связывания. В последнее время наблюдается растущий интерес к применению дрожжевого поверхностного дисплея для скрининга ферментативной модификации вариантов субстрата с аддитивными (например, фосфорилированием) или субтрактивными (например, протеолиз) модификациями, обеспечивающими фенотип, читаемый с помощью проточной цитометрии. Такие модификации регулярно применяются с использованием внутриклеточной колокализации, но возможность достижения внеклеточной ферментативной модификации отображаемых субстратов может открыть гораздо больше реакций для исследования. В данной статье мы описываем методы разработки и применения скрининговых анализов для внеклеточной ферментативной модификации субстратов-кандидатов, отображаемых на поверхности дрожжей, и последующей оценки с помощью анализа проточной цитометрии. Мы приводим эти протоколы в контексте фосфатаз, дефосфорилирующих дрожжевые субстраты, содержащие фосфорилированные остатки тирозина, и комментируем, как эта прикладная структура может быть адаптирована для разработки скрининговых анализов для других пар фермент-субстрат.

Понимание взаимодействий между ферментами и их мишенями становится все более интересной областью исследований из-за его необходимости в биологической характеристике путей, контролирующих клеточный гомеостаз^{и развитие заболеваний.} Ферменты отвечают за катализ многих реакций, поддерживающих биологическую жизнь, контролируя необходимые пути, такие как клеточный метаболизм ^3,4, передача сигналов⁵ и даже фундаментальные процессы, такие как восстановление генома ^6,7. В связи с их ролью в этих процессах, их взаимодействие также играет роль в развитии многих заболеваний, так как отклонения в их активности могут вызвать серьезную дисрегуляцию активности клеток, вызывая апоптоз или пролиферацию вредных раковых клеток². Изучение ферментативной активности имеет важное применение при разработке новых терапевтических средств ^8,9, требующих анализов, адаптированных к каждому конкретному взаимодействию фермента и субстрата¹⁰. Множественные ферментативные анализы были установлены в качестве стандартных протоколов для оценки и характеризации этих взаимодействий. Анализы, разработанные для анализа ферментативных взаимодействий, классифицируются на детекционные анализы, которые отслеживают связывание для активации/ингибирования¹¹, или анализы, которые контролируют модификацию субстрата ферментами¹².

Одной из основных ролей ферментов является регулирование поведения клеток. Сигнальная трансдукция, внутриклеточный ответ клетки на внеклеточный триггер¹³, отвечает за выживание и функциональность клетки. Пролиферация клеток, дифференцировка и многие другие функциональные процессы включают в себя сигнальные пути с ферментативными взаимодействиями, регулирующими их^14,15. Ферменты катализируют посттрансляционные модификации, которые часто модулируют массивные сигнальные сети, ответственные за правильную передачу внеклеточных сообщений¹⁶. Фосфорилирование белков является наиболее распространенной посттрансляционной модификацией, повсеместно присутствующей в клеточной сигнализации и многих других клеточных путях. Следовательно, протеинкиназы стали значительной частью потенциальных терапевтических мишеней из-за их критической регуляторной^роли. Фосфатазы являются естественными модулирующими молекулами для клеточных сигнальных комплексов^18,19 на основе фосфатов, обладающих способностью удалять остатки фосфатов из белков-мишеней²⁰. В последнее десятилетие фосфатазы стали основной терапевтической мишенью для лечения^рака21 и воспалительных^{заболеваний22} на основе их участия в регуляции нисходящих сигнальных путей в нескольких типах клеток. Вместе протеинкиназы и фосфатазы обеспечивают широкий спектр взаимодействий, которые могут быть изучены путем разработки специальных протоколов ферментативного анализа.

Отображение поверхности дрожжей было использовано в качестве инструмента для определения характеристик и оценки ферментативной активности ^23,24. Он обеспечивает высокопроизводительную платформу для скрининга процессов посттрансляционной модификации в сочетании со стратегиями секвестрации эндоплазматического ретикулума^25,26. Это позволяет парам киназа-субстрат быть колокализованными и удерживаться в эндоплазматическом ретикулуме путем связывания с рецепторами²⁷ KDEL, где фосфорилирование субстрата может происходить с повышенной скоростью из-за близости между киназами и их мишенями. Связывание рецептора KDEL опосредовано С-концевой эндоплазматическим ретикулумом FEHDEL, которая, как было показано, обладает более сильной удерживающей способностью, чем другие последовательности HDEL^25,28. Затем фосфорилированный субстрат закрепляют на поверхности дрожжей для его последующей оценки с помощью проточной цитометрии²⁹. В настоящее время не существует обобщенных протоколов для ферментативной модификации субстратов, отображаемых на поверхности дрожжей. Мы расширяем возможности отображения поверхности дрожжей, используя преимущества внеклеточно экспрессируемых фосфорилированных вариантов субстрата и модифицируя их путем дефосфорилирования известной фосфатазой. Анализ проточной цитометрии затем обеспечивает платформу для фенотипической оценки вышеупомянутых субстратов путем измерения изменений в медиане фосфорилирования в результате инкубации с известной фосфатазой. Это обеспечивает адаптируемый метод посттрансляционной модификации поверхностно-отображаемых белков, а также метод ферментативного модифицированного анализа взаимодействий при использовании платформы поверхностного отображения дрожжей.

Мы представляем методы разработки и применения анализа ферментативной модификации, который описывает введение взаимодействия киназы-субстрата в платформу отображения поверхности дрожжей, совместную инкубацию экспрессированного фосфорилированного субстрата с рекомбинантной фосфатазой и последующий анализ активности дефосфорилирования с помощью проточной цитометрии. В данном отчете это достигается за счет совместной локализации цитоплазматического домена CD28 с лимфоцитарной киназой (LCK) в эндоплазматическом ретикулуме дрожжей с последующим отображением фосфорилированного CD28 на поверхности дрожжей и последующим дефосфорилированием с помощью домена, содержащего фосфатазу-2 (SHP-2) области гомологии Src 2. Пан-антифосфотирозиновое антитело (в данном исследовании 4G10), которое обнаруживает фосфорилированные остатки тирозина в широком спектре пептидных последовательностей, используется для количественной оценки уровня фосфорилирования в зависимости от обработки фосфатазой. Детально описанный процесс обеспечивает обобщенный подход к исследованию фермент-субстратных взаимодействий; Перспективный способ изучения ферментов и субстратов в очищенном виде.

1. Рост клеток дрожжей, содержащих плазмиду и индукция экспрессии белка

1. Следуя рецептуре, описанному в таблице 1, приготовьте среды, необходимые для роста неплазмидных дрожжей (YPD), роста плазмидсодержащих дрожжевых клеток (SD-CAA) и индукции экспрессии белка (SRG-CAA), а также планшетов SD-CAA.
2. Трансформируйте ДНК дрожжевой дисплейной плазмиды, содержащей пару киназа-субстрат, в дрожжевые клетки EBY-100 с помощью метода^30,31 на основе катионов лития, обычно используемого для использования в наборах для трансформации дрожжей от различных производителей.
   Примечание: Электропорация³² или другие предпочтительные методы трансформации дрожжевой плазмиды могут быть использованы в зависимости от трансформируемой плазмидной конструкции.
3. Приготовьте культуральную пробирку объемом 14 мл с 10 мл среды YPD. Инокулируют клетки EBY-100 и выращивают в встряхивающем инкубаторе при 30 °С, 300 об/мин до тех пор, пока культура не достигнет оптической плотности (наружный диаметр_{600 нм)} 0,8-1,0 (8 x 10⁶- 1 x 10⁷ клеток/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наружный диаметр_{600 нм} измеряют путем приготовления 3 мл образцов кювет, содержащих 1:10 разведения дрожжевых культур в соответствующих средах, и 3 мл чистых кювет, содержащих среды, используемые для разведения образца. Программа наружного диаметра_{600 нм} на спектрофотометре используется для измерения сначала заготовки кюветы, затем каждой кюветы образца путем установки соответствующего разведения, подготовленного для каждого образца. 1 наружный диаметр_{600 нм} соответствует 1 ×^{10 7} дрожжей/мл.
4. Соберите клетки путем центрифугирования культуры при 1000 x g в течение 3 мин и промойте^1-м моющим раствором, входящим в комплект для трансформации дрожжей, или TE (10 мМ Tris-HCl и 1,0 мМ ЭДТА)³¹.
5. Снова гранулируйте клетки в дозе 1000 x g в течение 3 минут и повторно суспендируйте в 1 мл буфера для трансформации, предоставленного в наборе для трансформации дрожжей, или в стерильной воде. Элементы должны быть аликвотированы в 50 мкл аликвот и могут храниться при температуре -80 °C до 6 месяцев.
6. Для трансформации плазмиды готовят одну аликвоту на плазмиду и размораживают на льду, затем непосредственно в клетки добавляют 0,5-1,5 мкг плазмидной ДНК, содержащей конструкцию дисплея дрожжей. Добавляют 0,5 мл раствора для трансформации, предусмотренного в наборе для трансформации дрожжей, или 0,5 мл стерильного 50% полиэтиленгликоля и 0,1 М раствора LiOAc³¹. Тщательно соедините смесь клеток, плазмидной ДНК и раствора трансформации с помощью пипетирования.
7. Смесь для трансформации инкубировать статически в течение 30-60 мин при 30 °C, вихревую смесь с интервалом 15 мин. Соберите клетки центрифугированием при 1 000 × г в течение 3 минут.
8. Приготовьте культуральную пробирку объемом 14 мл с 4,5 мл среды SD-CAA. Ресуспендируйте клетки, содержащие нужную плазмиду, в 500 мкл SD-CAA и инокулируйте приготовленные 4,5 мл.
9. Стараясь не проколоть агар, распределите 50 мкл из 5 мл инокулированной культуры на планшет SD-CAA и статически инкубируйте при 30 °C в течение 48 ч, чтобы определить эффективность трансформации.
10. Инкубируйте 5 мл клеточной культуры SD-CAA в встряхивающем инкубаторе при 30 °C, 300 об/мин в течение не менее 18 ч. Контролируйте оптическую плотность (наружный диаметр_{600 нм)} через 16 ч и 20 ч. После того как образец вырос до достаточной оптической плотности, не превышающей 6, центрифугируйте культуру в течение 3 мин при концентрации 2500 × г. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив дрожжевые гранулы.
11. Ресуспендируйте дрожжевую гранулу в SRG-CAA до конечного наружного диаметра_{600 нм} менее 1 (<1 × 10⁷ дрожжей/мл).
12. Культуру дрожжей инкубировать в встряхивающем инкубаторе при температуре 30 °С, 300 об/мин не менее 8 ч, но не дольше 24 ч.
    Примечание: Индукция экспрессии белка в дрожжевых клетках может варьироваться в диапазоне от 20 до 37 °C. 30 °C подходит для синтеза пар киназа/субстрат ^29,33, но может быть скорректирована, если сочтет необходимым для конкретных изучаемых белков.
13. Измерьте наружный диаметр_{600 нм} для определения плотности ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол можно остановить, храня дрожжевые культуры при температуре 4 °C.

2. Биотинилирование антифосфотирозиновых антител 4G10

1. Ресуспендируйте флакон 2 мг PEG4-NHS-биотина до конечной концентрации 5 мМ, добавив 680 мкл стерильного PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспендирование PEG4-NHS-биотина следует проводить непосредственно перед проведением реакции биотинилирования. NHS гидролизуется в водном растворе. Использование стерильных PBS и флаконов важно для подготовки реагентов к длительному хранению и для использования в клеточных анализах для смягчения любого потенциального воздействия загрязняющих веществ на жизнеспособность реагентов или выполняемые чувствительные анализы.
2. Исходя из концентрации антитела 4G10, добавьте 100 мкг антитела в стерильный флакон объемом 1,7 мл.
3. Добавьте 1 мкл приготовленного 5 мМ PEG4-NHS-биотина с этапа 2,1 во флакон, содержащий 100 мкг антитела 4G10, для достижения молярного соотношения биотина к антителам 7,5:1. Аккуратно пипетируйте смесь, чтобы гомогенизировать реакцию.
4. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре при постоянном вращении не менее 2 ч.
5. Следуйте протоколу производителя для спиновых обессоливающих колонн объемом 0,5 мл для замены буфера из биотинилированного 4G10 (B-4G10) в PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обессоливающие колонки с молекулярной массой (MWCO) 7 кДа обычно используются для биотинилирования антител, что позволяет удалить непрореагировавший биотин и другие малые молекулы, сохраняя при этом более крупные антитела.
6. Разбавьте антитело B-4G10 до конечной концентрации 1 мкМ в PBSA (PBS с 1 г/л бычьего сывороточного альбумина). Аликвотируйте антитела B-4G10 в меньшие объемы, чтобы предотвратить повторные циклы замораживания/размораживания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биотинилированные антитела могут храниться при температуре 4 °C для ежедневного использования до 3 месяцев без существенной потери эффективности. Остальные неиспользованные аликвоты храните при температуре -20 °C не более 2 лет.

3. Дефосфорилирование субстратов, экспрессируемых на поверхности дрожжевых клеток

1. Приготовьте рабочий буферный раствор 2x, как описано ранее в литературе³⁴.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется 2x для облегчения измерения необходимых ингредиентов.
2. Приготовьте рабочий буфер для образцов во флаконе объемом 1,7 мл, разбавив 2x буферный раствор, приготовленный на шаге 3.1 1:2 в деионизированной воде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общий реакционный объем для каждого образца составит 20 мкл, и для каждого образца потребуется от 10 до 18 мкл рабочего буфера. Подготовьте достаточное количество рабочего буфера для всех образцов или контрольных элементов.
3. После рекомендованной пробоподготовки, описанной в таблице 2, пометьте флаконы объемом 1,7 мл соответствующим контрольным или наименованием образца.
4. На основе наружного диаметра_{600 нм,} измеренного на шаге 1.9, рассчитайте объем культуры, необходимый для извлечения двух миллионов (2 × 10⁶) дрожжевых клеток из соответствующей культуры дрожжей для каждого образца.
5. В флакон объемом 1,7 мл для каждого образца добавьте рассчитанный на предыдущем шаге объем культуры дрожжей.
6. Центрифугируйте флакон в течение 1 минуты при концентрации 4 500 × г. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки и выбросьте как биологически опасные отходы.
7. Повторно суспендируйте гранулированные клетки в 1 мл PBSA и повторите шаг 3.6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить как можно больше надосадочной жидкости, не нарушая гранулированные клетки.
8. Исходя из исходной концентрации, рассчитайте объем рекомбинантного человеческого SHP-2, необходимый для получения конечной концентрации 1000 нМ в общем объеме реакции 20 мкл.
   Примечание: Рекомбинантный SHP-2 следует аликвотировать в небольших объемах, чтобы любой белок, используемый в каждом анализе, не прошел более двух циклов замораживания-размораживания. Любой SHP-2, оставшийся от аликвоты после того, как все образцы были подготовлены для анализа, должен быть отбракован.
   Исходные концентрации рекомбинантных ферментов могут варьироваться в зависимости от номера партии. Рекомбинантный SHP-2 обычно изготавливается в исходной концентрации 0,2-0,4 мг/мл. Для исходной концентрации 0,324 мг/мл SHP-2 это соответствует исходной концентрации 4,696 мкМ (SHP-2 имеет молекулярную массу 69 кДа). 4,26 мкл запаса SHP-2 в реакции объемом 20 мкл приводит к конечной концентрации SHP-2 в 1000 нМ SHP-2.
9. Добавьте 7,7 мг DTT в 10 мл деионизированной воды, приготовленной в конической форме объемом 15 мл, чтобы получить раствор DTT массой 5 мМ. Если ограничения оборудования затрудняют взвешивание миллиграммов, добавьте 0,77 г DTT к 10 мл деионизированной воды, затем выполните 100-кратное разбавление, чтобы получить 5 мМ раствор DTT, используемый для анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор DTT может быть приготовлен в исходных растворах с более высокой концентрацией, которые должны быть разбавлены до 5 мМ, если невозможно измерить количество в миллиграммах с помощью имеющегося оборудования. Раствор DTT необходимо готовить свежей предшествующей ресуспензией клеток в рабочем буфере из-за его склонности к гидролизу, что делает его нестабильным в течение длительного времени при разбавлении в воде.
10. Повторно суспендируйте гранулированные элементы в рабочем буфере, подготовленном на стадии 3.2, таким образом, чтобы конечный объем реакции в каждом образце или контроле составлял 20 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество добавленного рабочего буфера должно быть рассчитано на основе количества DTT (2 μL) и SHP-2 (рассчитанного на шаге 3.8), которое будет в каждом образце.
11. Добавьте 2 мкл 5 мМ раствора DTT, приготовленного на стадии 3.9, в каждый образец или контрольную часть до конечной реакционной концентрации 0,5 мМ DTT.
12. Добавьте объем SHP-2, рассчитанный на шаге 3.8, в каждый образец до конечного объема 20 мкл и аккуратно перемешайте с помощью микропипетки.
13. Оберните крышки флаконов с образцами парапленкой, чтобы предотвратить утечку или перекрестное загрязнение.
14. Инкубируйте образцы при температуре 37 °C в течение 2 ч на роторе с постоянной частотой вращения.
15. Извлеките образцы из ротора и остановите реакцию, добавив 1 мл PBSA в каждую пробу.
16. Повторите шаг 3.6.

4. Мечение клеток и анализ проточной цитометрии дефосфорилированных субстратов

1. Ресуспендируйте образцы с этапа 3.16 в смесь соответствующих первичных реагентов объемом 20 мкл, как описано в таблице 2. Инкубируйте образцы в течение 20 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все используемые концентрации реагентов были рассчитаны как превышающие количество белков, экспрессируемых на поверхности дрожжевых клеток. Расчет предполагает экспрессию 10 000 белков на клетку от всех 2 x 10⁶ дрожжей в образце³⁵, в то время как обычно это делают только ~50% из них. В таблице 3 показано избыточное соотношение реагентов для мечения для каждого из реагентов, выраженное в таблице 2, рассчитанное следующим образом:
   
2. Центрифугируйте образцы при концентрации 4 500 × г в течение 1 минуты и выбросьте надосадочную жидкость как биологически опасные отходы.
3. Промойте клетки один раз, повторно суспендируя в 1 мл PBSA. Повторите шаг 4.2.
4. Ресуспендируйте образцы в смесь соответствующих вторичных реагентов объемом 20 мкл, как описано в таблице 2. Инкубируйте образцы в течение 15 минут при отсутствии света.
5. Повторите шаг 4.2.
6. Повторите шаг 4.3.
7. Повторно суспендируйте промытые образцы в 300-500 мкл PBSA и переложите в полистирольные пробирки объемом 5 мл для немедленного анализа с помощью соответствующего проточного цитометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо транспортировать образцы, держите их на мокром льду. Это не рекомендуется, но образцы можно хранить при температуре 4 °C не более 2 часов в виде влажных гранул.
8. После выполнения необходимого запуска и подготовки цитометра к новому эксперименту нажмите кнопку «Новый эксперимент » в меню «Файл », назовите эксперимент и нажмите «Сохранить », чтобы убедиться, что полученные данные сохраняются в нужном пути к файлу.
9. Выберите значок точечной диаграммы на верхней панели инструментов, чтобы создать две или более точечных диаграмм для каждого запускаемого образца. Для одной из точечных диаграмм выберите имя по оси X, чтобы отобразить канал FSC-A, и имя по оси Y, чтобы отобразить канал SSC-A. Этот график показывает боковое рассеивание - площадь в сравнении с прямым рассеиванием - площадь и используется для шлюзования дрожжевых клеток для дальнейшего анализа.
10. На другой точечной диаграмме выберите имя по оси X, чтобы отобразить канал, в котором флуоресцирует вторичный реагент, нацеленный на первичное антитело антиэпитопной метки. Выберите имя по оси Y, чтобы отобразить канал, в котором флуоресцирует вторичный реагент стрептавидина. На этом графике будут показаны только события, забитые с боковой стороны по сравнению с прямой диаграммой рассеяния в виде дрожжевых клеток, и он используется для отображения фосфорилирования тирозина по оси Y и экспрессии поверхности субстрата по оси X.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном примере вторичный реагент, нацеленный на первичное антитело против эпитопной метки, флуоресцирует в канале FITC (AF-488), а вторичный реагент стрептавидина флуоресцирует в канале AF-647. Используемые каналы могут различаться в зависимости от первичных и вторичных реагентов, используемых при мечении.
11. Поместите каждую пробирку с образцом в держатель пробирки цитометра и выберите «Запустить», чтобы цитометр начал загрузку образца и сбор данных. При необходимости настройте события для отображения, события для записи, время для записи и скорость потока выборки.
12. Определите ворота, окружающие здоровые дрожжевые клетки, на графике SSC-A и FSC-A, созданном на шаге 4.9. На рисунке 1 показано описательное представление применяемой стратегии стробирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На графике SSC-A в сравнении с FSC-A 100 000 событий для отображения и 50 000 событий для записи в пределах определенного дрожжевого затвора является хорошим ориентиром для визуализации и сбора достаточного количества данных для дальнейшего анализа. Более строгие стратегии стробирования для отбора синглетных дрожжей могут быть применены на основе графика зависимости прямой высоты рассеяния от прямой площади рассеяния, о чем недавно сообщалось³⁶. Стратегия стробирования, показанная на рисунке 1 , соответствует менее строгому подходу, включающему синглетные и некоторые дублетные дрожжи с помощью дистракционного стробирования.
13. Запись флуоресценции всех контрольных образцов с помощью анализатора проточной цитометрии. Сначала обычно собираются контрольные выборки, чтобы помочь определить стратегию стробирования, как описано ниже на шаге 4.14.
14. Определите стратегию литникования для графика, созданного на шаге 4.10, перед анализом обработанных образцов. На рисунке 1 показано описательное представление применяемой стратегии стробирования.
15. Зарегистрируйте флуоресценцию дефосфорилированных образцов с помощью проточного цитометра и стратегии стробирования, определенной в шагах 4.12 и 4.14.
16. Анализируйте данные проточной цитометрии, полученные с помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии.
17. Оцените дефосфорилирование путем измерения и сравнения медианы по оси Y клеток, экспрессирующих белок на своей поверхности, и исходного фосфорилирования, обеспечиваемого непроявляющими клетки между образцами и контролем. Рассчитайте разницу в процентах медианного фосфорилирования следующим образом:
    

Анализ проточной цитометрии из отдельной реплики нашей модельной системы, инкубированной в течение 2 ч без (рис. 1A) и с (рис. 1B) 1000 нМ SHP-2, показал медианную разницу в фосфорилировании в размере 63,6%, которая определяется как отношение медианы по оси Y (фосфорилирования) от всех отображаемых на поверхности событий минус исходный сигнал фосфорилирования, определенный как медиана по оси Y неотображаемых событий между обработанным образцом и необработанным контролем, как описано в уравнении определено в шаге 4.12 протокола. Перед анализом медиан образцы были скобированы на основе их размера (прямое рассеяние) и сложности (боковое рассеивание), чтобы охватить здоровую группу клеток. При определенных условиях дефосфорилирование образца должно быть различимо на виду (рис. 1В).

Анализ определяется простой процедурой, состоящей из четырех основных методов (Рисунок 2A). Система отображения поверхности дрожжей, которую мы использовали и которая была опубликована ранее, основана на плазмиде, содержащей двунаправленный промотор со способностью к одновременной индуцируемой экспрессии пары киназа-субстрат, состоящей из цитоплазматического хвоста CD28 и тирозинкиназы LCK (рис. 2B)²⁹. Ко-локализация транслируемых белков управляется эндоплазматическим ретикулумом, нацеленным на сигнальный пептид, и посттрансляционной модификацией, вызванной увеличением времени пребывания в результате С-концевой последовательности удержания ER. Секреция фосфорилированного субстрата, слитого с Aga2p, приводит к поверхностной экспрессии (рис. 2C). Субстрат спроектирован таким образом, чтобы быть окруженным двумя эпитопными метками, что позволяет внеклеточному подтверждению успешной трансляции и последующей поверхностной экспрессии. Инкубация субстрата, содержащего дрожжевые клетки с представляющей интерес фосфатазой (в данном случае тирозинфосфатазой SHP-2), позволяет проанализировать модификацию фермента за счет снижения связанного с субстратом фосфата (рис. 2D).

Несмотря на то, что для представленной модельной системы были определены оптимальные условия, обобщаемость анализа позволяет диверсифицировать белки, подлежащие анализу. Оптимальные условия для анализа были определены с помощью серии титрований, в которых оценивались различные комбинации времени и концентрации фосфатазы в квадрупликации (рис. 3). Проанализированные данные продемонстрировали статистическую значимость с помощью двустороннего ANOVA с репликацией (p < 0,05). Выбранные условия в 2 ч и 1000 нМ (48,8% ± 10%) показали примерно 50% разницу в медиане фосфорилирования при сохранении статистической значимости по сравнению с аналогом 750 нМ через 2 ч (p < 0,05) на основе анализа t-критерия с неравной дисперсией. T-критерий также не выявил существенной разницы с результатом через 2 ч и 1000 нМ путем увеличения времени на 1 ч при любой из концентраций, которые обеспечивали приблизительную медианную разницу в процентах фосфорилирования (p > 0,05 для 500 нМ, 750 нМ и 1000 нМ через 3 ч).

Апостериорный анализ Tukey HSD показывает, что все средние сравнения между инкубационными периодами для всех концентраций значительно различаются, за исключением 1 ч и 2 ч. При сравнении нескольких протестированных концентраций мы наблюдаем только статистически значимые средние различия при сравнении 250 нМ со всеми другими концентрациями, что указывает на то, что в группах ожидаются сопоставимые уровни активности фосфатазы, за исключением 250 нМ. Несмотря на наблюдание 20% разницы при обработке образцов в течение 4 ч и 1000 нМ SHP-2 (22,1% ± 5,5%) по сравнению с оптимальными условиями (t-критерий, p < 0,05), мы решили не использовать эту комбинацию из-за снижения поверхностной экспрессии и ухудшения здоровья дрожжей из-за длительной инкубации с DTT. Мы предполагаем, что это вызвано восстановительными условиями рабочего буфера, который необходим для правильной функции фосфатазы SHP-2.

Рисунок 1: Анализ проточной цитометрии модельной системы. Плотностные графики, отображающие прямое рассеяние (ось X) в сравнении с боковым рассеянием (ось Y) (слева) и точечные графики, отображающие поверхностную экспрессию через субстрат, маркировку С-концевых эпитопных меток (ось X) в сравнении с фосфорилированием субстрата (ось Y) (в центре) цитоплазматического домена CD28, инкубированные в течение 2 ч (A) без SHP-2 и (B) с оптимальной концентрацией SHP-2, определенной как 1 000 нМ. Y-медиана измерялась в пределах определенных стробов, охватывающих поверхностные экспрессируемые клетки (зелеными) только в качестве измерения относительного фосфорилирования. Неотображаемые события сигнала были стробированы для определения фонового измерения Y-медианы (серый цвет). (C) Наложение точечной диаграммы образцов, показывающее четкую разницу в Y-медиане. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Ферментативная модификация поверхности дрожжей отображает белки. (A) Схема анализа, показывающая важнейшие этапы в рамках четырех описанных методов: подготовка образцов с фосфатазой (тан) для ферментативного анализа, инкубация для получения желаемой ферментативной активности, промывка клеток и мечение для обнаружения активности, а также анализ проточной цитометрии и сбор данных. (B) Схема гена, представляющая общую структуру кассеты, используемой для секвестрации эндоплазматического ретикулума пары фермент-субстрат и поверхностной экспрессии субстрата. (C) Графическое представление совместной локализации эндоплазматического ретикулума пары киназа-субстрат (слева) с последующей секрецией посттрансляционно модифицированного субстрата, отображаемого на поверхности дрожжей и меченного антифосфотирозиновым антителом (синий) и антителом антиэпитопной метки (розовый) для подтверждения поверхностной экспрессии (справа). (D) Инкубация дрожжевых клеток с фосфатазой (таном) удаляет фосфатную группу из отображаемого субстрата, нарушая мечение антифосфотирозиновых антител, облегчая анализ ферментативной модификации с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Активность фосфатазы и временное титрование. Дрожжевые клетки подвергались воздействию нескольких комбинаций времени и концентрации фосфатазы с последующим анализом проточной цитометрии. Все обработанные образцы сравнивали с контрольной группой, инкубированной в течение того же периода времени и в буферных условиях без SHP-2. Процентная медианная разница фосфорилирования была определена как отношение Y-медианы от поверхностных отображаемых событий к базовому шумовому сигналу, обеспечиваемому Y-медианой в неотображаемых событиях в образцах, содержащих SHP-2, деленное на то же отношение в их соответствующем контроле. Нулевая гипотеза отвергается при обнаружении существенных различий при сравнении изменений между группами времени и концентраций с использованием двустороннего ANOVA (p < 0,05). Влияние описанных переменных на процентную медианную разницу фосфорилирования не зависит друг от друга (взаимодействие p > 0,05). Тест HSD Тьюки был проведен для апостериорного анализа для получения дополнительной информации о значимости различий между общим временем инкубации и группами концентрации, а серия t-тестов, предполагающих неравную дисперсию, была использована для определения статистической значимости отдельных групп в указанное время и концентрацию. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения четырех реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Рекомендации по приготовлению сред для роста дрожжей и индукции белка. Табличное описание массы, необходимой для каждого химического компонента для приготовления 1 л селективной дрожжевой питательной среды, селективной среды для индукции дрожжевого белка и пептона декстрозы дрожжевого экстракта. После того, как описанная среда была должным образом перемешана, процедите и простерилизуйте перед ее использованием. В комплект входят дополнительные инструкции по изготовлению пластин для селективной дрожжевой среды для роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Рекомендуемая подготовка образцов для стратегии дефосфорилирования субстрата и мечения антител. Табличное описание образцов, необходимых для измерения ферментативных модификаций фосфорилированных субстратов, отображаемых на поверхности дрожжей. Пробоподготовку и последующую стратегию мечения антител определяют как для требуемого контроля, так и для каждого анализируемого образца, включая соответствующие разведения мечеющих реагентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Расчет отношения антител к избытку белка. Табличное описание теоретического числа антител, доступных для белка, экспрессируемого на поверхности дрожжевой клетки при мечении для проточной цитометрии. Выраженное теоретическое число предполагает, что 100% дрожжевых клеток экспрессируют 10 000 белков на своей поверхности для обеспечения избытка антител, а расчеты коэффициента избытка основаны на концентрации запаса реагентов, отображаемой в таблице и полученной от поставщика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица S1: Аминокислотная последовательность конструкционных кассет. Табличное представление аминокислотной последовательности для конструкционных кассет, расположенных по обе стороны от промотора Gal 1-10. Выделенные последовательности соответствуют их описаниям с цветовой кодировкой. Сторона плазмиды Gal-10 представлена в виде обратной трансляции аминокислотной последовательности для облегчения ее понимания. Все символы, оставленные черным цветом, соответствуют аминокислотной трансляции сайтов переваривания фермента рестрикции, используемой для обеспечения модульности конструкции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Представленный протокол позволяет проводить анализ ферментативных взаимодействий с использованием внеклеточного отображения белков на поверхности дрожжей. Включение секвестрации эндоплазматического ретикулума в используемую плазмиду с поверхностным дисплеем открывает возможности для анализа специфических взаимодействий между ферментами и посттрансляционно модифицированными субстратами внеклеточно, благодаря внутриклеточным взаимодействиям, которые могут быть спроектированы таким образом, чтобы они происходили^27,29. Ранее проведенные анализы ферментативных взаимодействий с использованием поверхностного дисплея дрожжей включают экспрессию представляющих интерес белков внутриклеточно, при этом поверхностный дисплей является исключительно инструментом для обнаружения внутриклеточных взаимодействий, происходящих между белками-мишенями 23,25,29.

Этот протокол опирается на эту платформу, перемещая целевые ферментативные взаимодействия во внеклеточную среду, что обеспечивает дополнительную гибкость как ферментам, которые могут быть изучены, так и среде, в которой контролируется их активность. Изучаемые взаимодействия, происходящие внеклеточно, дают исследователям возможность адаптировать инкубационную среду таким образом, чтобы она была более оптимальной для ферментативной активности, расширяя ферменты, которые могут быть изучены, активность которых затруднена в дрожжевом эндоплазматическом ретикулуме, который представляет собой сильно окисляющую^среду. Кроме того, способность титровать концентрацию ферментов по отношению к данному субстрату позволяет проводить специфические анализы ферментативной активности, которые не могут быть выполнены внутриклеточно из-за гипотетического насыщения скорости реакции во время секвестрации.

В протоколе есть несколько важных шагов, которые необходимо отметить, чтобы гарантировать, что желаемый результат будет соблюден. Успешная трансформация изученных конструкций в дрожжи имеет важное значение для достижения оптимальных результатов на следующих этапах. Необходимо проводить тщательный мониторинг оптической плотности для отслеживания здорового роста культур и обеспечения того, чтобы они не разрастались до индукции белка или подготовки образцов. Логарифмическая фаза роста дрожжевых клеток охватывает период, когда производство белка является наиболее высоким, в то время как в стационарной фазе механизмы, ответственные за производство белка^{, останавливаются}. Помня об этом, измерения оптической плотности обеспечивают точное измерение фаз роста, в которых находятся культуры дрожжей, а такие этапы, как индукция белка и подготовка к анализам, должны выполняться вне стационарной фазы или при зарастании культур (наружный диаметр_{600 нм} < 6).

Для анализа ферментативной модификации описанная инкубационная среда была специфична для изучаемого фермента SHP-2 и осуществляемой ферментативной активности дефосфорилирования. DTT был использован для создания восстановительной среды, которую он обеспечивает во время инкубации с SHP-2³⁴. Поэтому важно точно измерять концентрации химических веществ, используемых для изменения инкубационной среды в ферментативных анализах, чтобы обеспечить постоянную ферментативную активность между образцами и экспериментами. SHP-2 использовался в качестве рекомбинантного белка, и он имеет решающее значение для регулирования температуры на различных этапах работы с ферментом. Для успешного анализа фермент не должен пройти более двух циклов замораживания-размораживания и должен находиться на льду во время подготовки каждого образца. Затем крайне важно аликировать рекомбинантный фермент в объеме, достаточном для удовлетворения требований анализа. Во время самой инкубации необходимо строго контролировать температуру на оптимальной для фермента температуре, в данном случае 37 °C, с постоянным движением ротора для обеспечения однородности инкубационной смеси.

Общий метод анализа с использованием рекомбинантных ферментов потребовал модификаций, специфичных для взаимодействия между SHP-2 и фосфорилированной подложкой, отображаемой на поверхности. Адаптация протокола к другим внеклеточным взаимодействиям фермент-субстрат включает в себя модификацию используемых последовательностей, буферной среды активности и реагента, используемого для обнаружения. Для анализа других взаимодействий киназа-субстрат-фосфатаза адаптация включает замену последовательностей белков для пары киназа-субстрат в их соответствующие положения в конструкционной кассете, описанной в дополнительной таблице S1. Белковая последовательность субстрата вместе по меньшей мере с киназным доменом представляющей интерес киназы должна быть включена в плазмиду, а фосфатаза, нацеленная на полученный фосфорилированный субстрат, должна быть в форме рекомбинантного белка. Репрезентативное взаимодействие между LCK, CD28 и SHP-2 является примером использования спроектированной секвестрации эндоплазматического ретикулума в конструкционной кассете в качестве инструмента для получения посттрансляционно модифицированных белков, подлежащих исследованию внеклеточно, с их ферментом-мишенью. Представляющие интерес субстраты, которые не нуждаются в посттрансляционных модификациях (например, субстраты, которые могут быть фосфорилированы внеклеточно с использованием добавленной киназы), могут экспрессироваться на поверхности дрожжей без парного фермента в конструкционной кассете. В этом случае последовательность белка для киназы, описанная в дополнительной таблице S1 , будет удалена, при этом в конструкционную кассету будет включена только последовательность субстрата. Из нашего предыдущего опыта мы отмечаем, что колокализация серин-треонинкиназы с известным субстратом приводила к отображению субстрата, который не был фосфорилирован (Ezagui and Stern, неопубликованные данные), поэтому перед применением внеклеточной фосфатазы необходимо провести тщательное тестирование успешной ферментативной модификации. Ранее мы опубликовали протокол для колокализации киназы и субстрата, который может быть полезен для данного квалификационного шага³⁹.

Киназы и фосфатазы часто содержат неспаренные остатки цистеина, которые при окислении образуют дисульфидные связи внутри белка или между белками, что может нарушить каталитическую активность белка из-за конформационного изменения^40,41. Понимание биохимии этого белка имеет важное значение для определения надлежащей реакционной среды для ферментативной модификации. В результате, восстановитель необходимо добавлять в инкубационную среду, чтобы используемый рекомбинантный белок оставался активным. DTT является распространенным восстановителем, используемым для этих целей, но концентрация в анализе должна быть оптимизирована. Использование слишком высокой концентрации DTT препятствует отображению субстрата на поверхности дрожжей, так как якоря Aga1p и Aga2p удерживаются друг относительно друга с помощью дисульфидных связей, которые восстанавливаются в присутствии DTT⁴². Концентрацию DTT доводили до минимальной концентрации, которая позволяла бы обеспечить относительную максимальную активность фосфатазы без вредного воздействия на поверхностные проявления субстратов⁴². Инкубационная среда для любого фермента, который анализируется, должна быть оптимизирована таким образом, чтобы обеспечить сохранение ферментативной активности при использовании в данном анализе. Если для фермента требуется восстановительная среда, значительно более сильная, чем 0,5 мМ DTT, используемая в этом анализе, платформа ограничена уменьшением поверхностного дисплея и может быть неоптимальной для конкретного ферментативного анализа. Аналогичным образом, 2-кратный буфер, использованный на стадии инкубации в данном протоколе, был включен из предыдущих исследований приемлемых буферов, способствующих активности SHP-2, и аналогичные исследования должны быть проведены для составления инкубационного буфера для любого другого фермента, используемого для данного анализа³⁴. Отправной точкой для создания таких буферов может быть поиск литературы по успешному применению интересующего фермента in vitro или рекомендация производителя фермента по активному буферу. Используемый рекомбинантный фермент должен быть титрован специально для этого анализа, чтобы определить приемлемую концентрацию и время инкубации, что позволяет проявить целевую ферментативную активность до сбора данных.

Для адаптации этого протокола к другим типам взаимодействия фермента и субстрата необходимо будет выбрать новые реагенты для обнаружения флуоресценции и титровать их для повышения чувствительности. Другие исследования продемонстрировали примеры этого, включая использование антител, нацеленных на эпитопную метку, для обнаружения наличия или отсутствия пептидных субстратов после обработки протеазой^23,25 и чувствительных к ацетилированию антител для обнаружения модификаций белков гистонов⁴³. Для квалификации этих реагентов необходимо установить положительный контроль (тот, который достоверно демонстрирует модификацию интереса) и отрицательный контроль (тот, который достоверно демонстрирует отсутствие модификации интереса). Это может быть сделано путем отображения на поверхности дрожжей конструкции, которая ранее продемонстрировала интересующую модификацию, или, в некоторых случаях, может быть установлено путем иммобилизации рекомбинантных белков или пептидов. Например, в случае фосфорилирования (и многих других посттрансляционных модификаций, представляющих интерес) пептиды известной последовательности могут быть синтезированы либо с фосфотирозином (положительный контроль), либо с немодифицированным тирозином (отрицательный контроль) и С-концевым биотином, который обеспечит иммобилизацию пептидов на гранулах, покрытых стрептавидином. Покрытые пептидами шарики могут быть помечены модификационно-специфичным антителом и оценены на специфичность и чувствительность обнаружения с помощью проточной цитометрии с помощью методов, аналогичных описанным в разделе 4. Различные разведения антител должны быть использованы для нахождения концентрации, которая обеспечивает максимальный сигнал положительного контроля, минимальный сигнал отрицательного контроля и уравновешивает достаточный избыток антитела на модифицированный белок (используя уравнение в примечании к шагу 4.1) с экономическими соображениями для количества экспериментов, которые должны быть проведены на одну аликвоту полученного антитела.

Мы описываем протокол адаптации легкости платформы отображения поверхности дрожжей для анализа внеклеточной ферментативной активности. Метод продемонстрирован с использованием фосфорилированного CD28, отображаемого на поверхности дрожжей и дефосфорилированного рекомбинантным SHP-2 во время инкубации, но он может быть обобщен для многих типов ферментативной модификации путем модификации используемого рабочего буфера и пары фермент-субстрат.

Авторы не имеют конфликта интересов, связанного с данной работой, который можно было бы раскрыть.

Эта работа была поддержана премией NSF CAREER L.A.S. (CBET - 2339172) и стартап-фондами из Университета Южной Флориды.

На рисунке 2A значок microtube-open-translucent от Servier https://smart.servier.com/ лицензирован под лицензией CC-BY 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/. Модификации включают добавление буфера и дрожжевой клетки (слева) и добавление антитела (в центре справа).

Пробирка, инкубатор и проточный цитометр на рисунке 2А были предоставлены через www.bioicons.com в открытом доступе.