Экстракция и идентификация микроядер из лимфоцитов периферической крови человека

В этом протоколе описан метод извлечения и очистки микроядер из лимфоцитов человека с помощью центрифугирования градиента плотности сахарозы. Он обеспечивает экспериментальную основу для исследования состава и функции микроядер.

Микроядро (МН) — это аномальная ядерная структура, которая образуется в клетках, особенно в клетках костного мозга или крови, при воздействии внешних повреждений, таких как радиация, из-за неразрешенного повреждения ДНК или митотических ошибок. После образования МН могут активно участвовать в различных канцерогенных процессах, включая воспалительную сигнализацию и хромосомные генетические перестройки. МН содержат ядерную ДНК, гистоны, фрагменты нуклеопротеинов и другие активные белки, которые тесно связаны с их функциями. Изучение образования и компонентов МН имеет решающее значение для понимания их роли в управлении канцерогенными процессами. Извлечение и очистка МН имеют важное значение для достижения этих исследовательских целей. Однако нестабильность ядерной мембраны MN и ее подверженность разрыву делают эти процессы технически сложными. В настоящее время только в нескольких исследованиях сообщалось об использовании центрифугирования с градиентом плотности для разделения MN. Данное исследование обобщает и упрощает процессы разделения и очистки MN. Лимфоциты периферической крови человека, подвергшиеся воздействию радиации, изолировали, а МН отделили и очистили с помощью буферов сахарозы разной концентрации в двухступенчатом процессе. Целостность и чистота МН были проверены, что обеспечило четкую и практическую демонстрацию экспериментальной процедуры для исследователей, изучающих причины и функции МН.

Микроядро (МН) — субклеточная структура цитоплазмы, содержащая ядерную ДНК, гистоны и фрагменты нуклеопротеинов, окруженная мембранными структурами ^1,2. MN полностью отделен от основного ядра и обычно появляется рядом с ним в овальной или круглой форме, с размером от 1/16 до 1/3 диаметра основного ядра. Образование МН в первую очередь связано с ацентрическими фрагментами хромосом, хромосомной миссегрегацией, разрывом дицентрической хромосомы, нестабильностью хромосом и агрегацией двойных минут (ДБ)³. МН редко встречаются в здоровых клетках и вызваны преимущественно воздействием экзогенных генотоксинов, что приводит к повреждению ДНК или митотическим ошибкам ^4,5. Радиационное повреждение является значительным фактором образования МН, и воздействие ионизирующего излучения (ИК) на человека увеличивается с развитием клинических и технологических применений ^6,7. Инфракрасное воздействие вызывает одноцепочечные разрывы (SSB) и двухцепочечные разрывы (DSB) в клеточной ДНК, что может привести к гибели клеток или апоптозу ^8,9,10. МН — это фрагменты хромосом, целых хромосом или хроматид, образующиеся в результате неотремонтированной или несоответствующей репарации DSB. Они служат критическими индикаторами степени ущерба, нанесенного ИК ^7,11,12. Всестороннее понимание компонентов МН имеет важное значение для смягчения побочных эффектов лучевой терапии и минимизации воздействия нежелательного излучения^{на население 6,13}. Тем не менее, белки и нуклеиновые кислоты, содержащиеся в МН, до сих пор остаются не полностью охарактеризованными.

Считается, что МН возникают в результате индукции различных типов повреждений ДНК. Их механизмы репликации и способности к восстановлению ДНК нарушаются, что приводит к обширному повреждению ДНК в течение короткого периода^{времени 3,14,15}. МН также являются важными индикаторами хромосомной нестабильности, которая неизменно присутствует в предраковых клетках 3,14,16,17,18,19. МН уже давно используются в качестве биомаркеров генотоксичности, риска развития опухолей и степени^{злокачественности опухоли 3,20,21}. После образования МН могут активно управлять многочисленными канцерогенными процессами, включая воспалительную сигнализацию^22,23 и хромосомную генетическую перестройку 24,25,26. Например, МН инициируют воспалительный каскад, рекрутируя рецептор распознавания вирусных образов (PRR) циклическую синтазу GMP-АМФ (cGAS) из цитоплазмы 4,22,23,27. Другие белки, которые могут присутствовать в МН, включают экзонуклеазы²⁸, транскрипционные механизмы⁴ и кофакторы трансляции. Остается неясным, собирают ли МН уникальный, смещенный белковый профиль из библиотеки цитоплазматических белков или пассивно приобретают белки с высоким содержанием из ядра и цитоплазмы во время их формирования. Помимо отдельных белков, таких как cGAS, степень, в которой конкретные среды влияют на общий состав MN, еще не определена. Понимание всего ландшафта микроядер ограничено, нет общедоступных наборов данных для исследования. Таким образом, извлечение полных и очищенных МН крайне необходимо для глубокого и всестороннего анализа их компонентов.

Одной из причин задержки репликации ДНК в МН может быть репликационный стресс, вызванный недостатком ферментов и кофакторов, необходимых для синтеза и репарации ДНК. Этот недостаток может быть результатом дефектной сборки ядерной оболочки MN, что приводит к отсутствию комплекса ядерных пор²⁰. Следовательно, МН не могут импортировать ключевые белки, необходимые для поддержания целостности ядерной мембраны и стабильности генома 2,29,30,31. Неполная ядерная мембрана MN подвержена разрыву, что делает экстракцию MN очень сложной.

В настоящее время МН в основном экстрагируются с помощью центрифугирования с градиентом плотности сахарозы ^27,32,33 и очищаются с помощью проточной цитометрии³⁴. В этом исследовании процесс разделения и очистки МН был обобщен и упрощен. Лимфоциты периферической крови человека, подвергшегося воздействию радиации, были выделены, а МН дважды очищены с использованием буферов сахарозы разной концентрации. Целостность и чистота МН были проверены, что предоставило исследователям практическую и интуитивно понятную экспериментальную демонстрацию для изучения причин и функций МН.

Все эксперименты с образцами периферической крови человека проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Данное исследование было одобрено Этическим комитетом больницы 416 атомной отрасли, Китай (Обзор 2020 г. [No 48]), и было получено информированное согласие всех участников. Критерии исключения включали лиц с серьезными хроническими заболеваниями, такими как опухоли, подагра или заболевания крови, а также тех, кто подвергался воздействию радиоактивных или генотоксических веществ в своей профессии. Для этого исследования 10 мл периферической крови было собрано у здорового 28-летнего мужчины в пробирку для сбора крови, содержащую гепарин натрия в качестве антикоагулянта. Образец облучали in vitro ⁶⁰Co γ-лучами при 37 °C с использованием стандартного устройства для терапии кинетической энергией гамма-воздуха. Доза облучения была установлена на уровне 4,0 Гр при мощности дозы 0,6350 Гр/мин. После облучения образец инкубировали при 37 °C в течение 2 ч, инокулировали в среду RPMI-1640 и культивировали при 37 °C в течение 60 ч. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Получение микроядра и ядра

1. Добавьте цитохалазин B в среду для клеток периферической крови до достижения конечной концентрации 10 мкг/мл. Выдерживать смесь в течение 45 минут при температуре 37 °C.
   Цитохалазин В является ингибитором полимеризации актина, который способствует эффективному отделению микроядер от ядра перед лизисом клетки³⁵.
2. Центрифугируйте клетки крови при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C.
3. Ресуспендируйте клетки крови в 10 мл 0,01 М PBS, предварительно охлажденном при 4 °C.

2. Выделение лимфоцитов

1. Добавьте 15 мл раствора для разделения лимфоцитов человека в коническую пробирку объемом 50 мл. Аккуратно нанесите слой взвешенных клеток периферической крови поверх разделительного раствора.
2. Центрифугируйте пробирку при 400 × г в течение 30 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования клетки крови в пробирке разделяются на четыре отдельных слоя сверху донизу: первый слой - это слой плазмы (тромбоциты), второй слой - это слой кольцевых молочно-белых лимфоцитов, третий слой - прозрачный слой разделительной жидкости, а четвертый слой - слой эритроцитов.
3. Осторожно перенесите второй слой (лимфоциты) в отдельную центрифужную пробирку. Добавьте PBS (0,01 M) в три раза больше объема переносимых клеток, хорошо перемешайте и центрифугируйте при 200 × г в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.

3. Лизис лимфоцитов

1. Поместите собранную в коническую трубку клеточную гранулу на лед.
2. Добавьте 6 мл буфера для холодного лизиса (Таблица 1, Дополнительный файл 1) и повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере для лизиса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса следует дополнить ингредиентами, перечисленными в Таблице 2, Дополнительном файле 1, непосредственно перед использованием.
3. Переложите лизат клеток в стеклянный гомогенизатор.
4. Аккуратно используйте рыхлый помол для ручной гомогенизации образца, перемещая гомогенизатор вверх и вниз 10 раз.
5. Перенесите гомогенизированный лизат клеток обратно в коническую пробирку объемом 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги осторожно и держите образец на льду.

4. Первоначальная изоляция МН с помощью градиента плотности сахарозы

1. Смешайте 5 мл клеточного лизата с равным объемом 1,8 М сахарозного буфера (Таблица 3, Дополнительный файл 1) для получения соотношения лизата и сахарозы 1:1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер сахарозы 1,8 М следует дополнить ингредиентами, перечисленными в Таблице 4, Дополнительном файле 1, непосредственно перед использованием.
2. Приготовьте градиент плотности сахарозы: Добавьте 15 мл буфера сахарозы 1,6 М (Таблица 5, Дополнительный файл 1) на дно конической пробирки объемом 50 мл. Медленно добавьте 20 мл 1,8 М сахарозного буфера (Таблица 3, Дополнительный файл 1) поверх 1,6 М сахарозного буфера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как 1,6 М буфер сахарозы, так и 1,8 М сахарозный буфер следует дополнять ингредиентами, указанными в Таблице 4, Дополнительном файле 1, соответственно, непосредственно перед использованием. Чтобы добавить буферы сахарозы, приложите кончик пипетки к верхней внутренней стороне конической трубки и медленно пипетируйте раствор.
3. Медленно нанесите пипеткой 10 мл смеси [Lysate 1:1 1,8 M sucrose buffer] поверх двухслойного градиента плотности сахарозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно добавляйте слои, чтобы убедиться, что средний буферный слой 1,8 М не смешивается с нижним буферным слоем 1,6 М, а верхняя смесь лизированных клеток 1:1 и буфера сахарозы 1,8 М не смешивается с буферным слоем 1,8 М.
4. Центрифугируйте пробирку в центрифуге с горизонтальным ротором при давлении 1000 × g в течение 20 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования жидкость разделится на три слоя: верхний слой содержит примерно 3 мл клеточного мусора, средний слой содержит примерно 3 мл микроядер (МН), нижний слой содержит примерно 39 мл ядер.
5. Удалите верхние 3 мл жидкости у поверхности и соберите 3 мл неочищенных микроядер из среднего слоя для второго градиента плотности сахарозы.

5. Вторичная очистка МН с помощью градиента плотности сахарозы

1. Подготовьте градиент плотности сахарозы:
   1. Добавьте 3 мл 1,8 М сахарозного буфера (Таблица 3, Дополнительный файл 1) на дно конической пробирки объемом 15 мл.
   2. Добавьте 3 мл 1,5 М сахарозного буфера (Таблица 6, Дополнительный файл 1) поверх 1,8 М сахарозного буфера.
   3. Наконец, добавьте 3 мл 1,4 М сахарозного буфера (Таблица 7, Дополнительный файл 1) поверх 1,5 М сахарозного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите кончик пипетки напротив верхней внутренней стороны конической трубки и медленно пипетируйте раствор.
2. Медленно пипеткой нанесите 3 мл среднего слоя из второго градиента плотности сахарозы на вершину трехслойного градиента плотности сахарозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте слои медленно, чтобы избежать смешивания.
3. Центрифугируйте пробирку в центрифуге с горизонтальным ротором при давлении 500 × г в течение 20 мин при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования верхний слой будет содержать 1-4 мл очищенных микроядер (МН), а нижний слой будет содержать в основном 8 мл ядер.
4. Оставьте верхние 1-4 мл очищенных микроядер для последующего использования.

6. Идентификация МН

1. Возьмите неочищенный раствор микроядер (полученный на шаге 4) и очищенный раствор микроядер (полученный на шаге 5) и приготовьте мазки клеток на предметном стекле.
2. Добавьте 4% раствор параформальдегида для фиксации образца при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут.
3. Вымойте предметные стекла PBS (0,01 М) дважды, по 3 мин на промывку.
4. Добавьте 0,1% Triton X-100 для проникновения в клетки при RT в течение 5 минут.
5. Заблокируйте клетки в 5% BSA при RT на 30 минут.
6. Добавьте первичное антитело против анти-γ-H2AX (разведенное в 5% BSA, 1:200) и инкубируйте в режиме лучевой терапии в течение 1 ч.
7. Вымойте предметные стекла PBS (0,01 М) дважды, по 5 мин на промывку.
8. Добавьте вторичное антитело (разведенное в 5% BSA, 1:500) и инкубируйте при RT в течение 1 ч в темноте.
9. Добавьте раствор красителя DAPI и инкубируйте при RT в течение 15 минут.
10. Вымойте предметные стекла PBS (0,01 М) дважды, по 3 мин на промывку.
11. Нанесите на предметное стекло герметизирующий раствор, чтобы запечатать его.
12. Наблюдайте за флуоресценцией под флуоресцентным микроскопом (увеличение: 400×, автофокус и автоэкспозиция) и подсчитывайте микроядра с помощью планшета для подсчета клеток.
    Примечание: 4% параформальдегида, 0,1% Triton X-100 и 5% BSA разбавляют PBS (0,01 M). γ-H2AX (Gamma H2AX) представляет собой фосфорилированную форму белка гистона H2AX, образующуюся в ответ на повреждение ДНК. В ядре фосфорилирование гистона H2AX концентрируется в определенных областях, поэтому флуоресценция против γ-H2AX может казаться пятнистой. Фосфорилирование гистона H2AX концентрируется в микроядре, что приводит к общей более яркой флуоресценции с отчетливыми пятнами³⁶. DAPI представляет собой флуоресцентный краситель, который прочно связывается с ДНК и часто используется во флуоресцентной микроскопии. Поскольку микроядра содержат разрушенные фрагменты ДНК и гистонов, они могут быть окрашены флуоресцентными антителами против γ-H2AX и DAPI. Флуоресценция покажет количество, размер и полноту микроядер, помогая отличить их от ядер и^{оценить эффективность очистки}.

После облучения периферическую кровь человека инкубировали с RPMI-1640 в течение 60 ч, а затем добавляли цитохалазин В для получения микроядер (МН). Лимфоциты выделяли с помощью раствора для разделения лимфоцитов с последующим лизисом специально сконфигурированным клеточным лизатом и щадящей гомогенизацией в стеклянном гомогенизаторе. Гомогенат смешивали в соотношении 1:1 с 1,8 М сахарозным буфером. Неочищенные микроядра были получены после первого центрифугирования с градиентом плотности сахарозы, а очищенные микроядра — после второго центрифугирования с градиентом плотности сахарозы (рис. 1).

После первого центрифугирования градиентом плотности сахарозы неочищенные микроядра препарировали в клеточные мазки и подвергали флуоресцентному окрашиванию анти-γ-H2AX и DAPI. Результаты показали широкий вариабель размеров неочищенных микроядер, при этом были видны некоторые более крупные микроядра (рис. 2A). После второго центрифугирования градиентом плотности сахарозы очищенные микроядра препарировали в клеточные мазки и подвергали флуоресцентному окрашиванию анти-γ-H2AX и DAPI. Результаты показали, что очищенные микроядра были меньше, а разница в размерах между микроядрами была менее выраженной, при этом больших ядер не наблюдалось (рис. 2B). На основе 10 мл периферической крови можно получить от 100 000 до 200 000 микроядер.

Рисунок 1: Принципиальная схема экстракции и очистки микроядер лимфоцитов после облучения. После облучения процесс включает в себя инкубацию, предварительное разделение микроядер, выделение лимфоцитов, лизис клеток и два раунда центрифугирования с градиентом плотности сахарозы. Затем с помощью этих этапов получают очищенные микроядра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Идентификация микроядер с помощью иммунофлуоресценции. (А) После первого центрифугирования градиентом плотности сахарозы неочищенные микроядра получали в виде клеточных мазков и подвергали флуоресцентному окрашиванию анти-γ-H2AX (зеленым) и DAPI (синим). Стрелками обозначены ядра. (B) После второго центрифугирования градиентом плотности сахарозы очищенные микроядра получали в виде клеточных мазков и подвергали флуоресцентному окрашиванию анти-γ-H2AX и DAPI. Масштабные линейки: 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Реагенты и буферы, используемые в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

В этом методе для выделения и очистки микроядер (МН) использовались облученные лимфоциты периферической крови человека. Во многих предыдущих исследованиях сообщалось о подробных этапах лизиса клеток и первичного разделения MNs 4,32,33,34. Раствор для лизиса клетки обычно содержит 0,1% NP-40 для разрушения клеточной мембраны, оказывая при этом минимальное воздействие на ядерную мембрану, тем самым сохраняя целостность как ядра, так и МН. Примечательно, что другие компоненты лизата также выполняют буферную роль 4,32,33,34. Из-за неполной сборки мембрана MN подвержена разрыву 2,29,30,31, что усложняет процесс разделения и очистки. Как правило, буферы сахарозы 1,6 М и 1,8 М используются в центрифугировании с градиентом плотности для начального разделения МН. Буферы сахарозы помогают защитить и буферизировать МН, обеспечивая целостность микроядерной мембраны и облегчая их разделение с помощью градиента плотности 4,32,33,34. В этом методе тщательно следовали эти ключевые этапы лизиса лимфоцитов и первичного разделения МН.

В отличие от предыдущих методов разделения микроядер (МН), этот метод улучшает процесс очистки. Ранее сообщалось об очистке МН с помощью проточной цитометрии^33,34. Тем не менее, MN могут разрываться из-за сил сдвига жидкости в процессе сортировки, что может затруднить дальнейшее обнаружение компонентов MN. Кроме того, ограниченная доступность проточных цитометров ограничивает широкое применение проточной цитометрии для сортировки MN. В других исследованиях для очистки МН использовалось вторичное центрифугирование с градиентом плотности сахарозы, но до вторичного центрифугирования использовалось сверхскоростное центрифугирование4. Такое высокоскоростное центрифугирование может привести к разрыву некоторых МН, что наносит ущерб последующему анализу компонент MN. В отличие от этого, в этом протоколе выделение и очистка МН является критически важным этапом. Для очистки МН используется вторичное центрифугирование с градиентом сахарозы, при этом МН-содержащий слой, полученный в результате первого центрифугирования с градиентом плотности сахарозы, подвергается непосредственно второму центрифугированию. Такой подход позволяет избежать повреждения МН, вызванного высокоскоростным центрифугированием.

Этот метод направлен исключительно на выделение и очистку МН из лимфоцитов периферической крови человека и не включает другие типы клеток, такие как опухолевые клетки. Будущие исследования будут направлены на демонстрацию очистки МН из различных типов клеток для повышения универсальности метода. Кроме того, объем очищенной смеси MN остается относительно большим. Будущие усилия будут сосредоточены на оптимизации градиента плотности сахарозы для получения высококонцентрированных растворов MN, что облегчит дальнейшие исследования состава и функции MN.

Появление МН отражает степень повреждения хромосом и ДНК и играет важную роль в репарации радиационных повреждений и образовании раковых клеток 7,11,12,13,14,16,17,18,19. Эти процессы тесно связаны с ролью и функциями белков, нуклеиновых кислот и других компонентов в составе МН. Таким образом, очистка МН имеет решающее значение для изучения их роли при заболеваниях, связанных с повреждением хромосом и ДНК. Этот метод усиливает стадию центрифугирования с помощью вторичного градиента сахарозы в процессе очистки MN и демонстрирует образование MNs в лимфоцитах периферической крови человека. Он также включает в себя лизис клеток, первичное разделение с использованием первого градиента плотности сахарозы и очистку вторым градиентом плотности сахарозы. Этот подход обеспечивает четкую экспериментальную основу для исследователей, изучающих причины и функции МН.

Никакой.

Все рисунки были созданы авторами через офис WPS. Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Медицинского колледжа Чэнду (CYZ19-38) и Программой поддержки науки и технологий провинции Сычуань (2024NSFSC0592).