Estamos tentando determinar o melhor método a ser usado para a previsão da significância do anticorpo dos glóbulos vermelhos. O ensaio de monócitos-macrófagos parece ser mais sensível do que o ensaio de monocamada de monócitos. Portanto, as perguntas que estamos tentando responder são se o ensaio de monócitos-macrófagos é um ensaio melhor para prever a significância do anticorpo dos glóbulos vermelhos, melhor do que o ensaio de monocamada de monócitos.
Os desafios experimentais com o ensaio de monocamada de monócitos e o ensaio de monócitos-macrófagos estão otimizando sua eficiência para permitir uma conclusão mais rápida, eliminando a necessidade de avaliação manual da fagocitose. Em outras palavras, o desafio é tentar semiautomatizar esses ensaios. O ensaio de monocamada de monócitos, no qual fui pioneiro, na verdade, em 1980, tem sido usado rotineiramente pelo Laboratório de Referência em Imunohematologia desde 1983 para ajudar a decidir quais autoanticorpos ou aloanticorpos de glóbulos vermelhos têm potencial para causar hemólise quando o sangue do doador é transfundido em pacientes com esses anticorpos.
Portanto, o MMA usa monócitos no ensaio, mas a hemólise mediada por anticorpos é tipicamente causada por macrófagos no baço ou no fígado. Portanto, aqui estamos explorando se o uso de macrófagos primários neste ensaio seria melhor do que monócitos como preditores de potencial significado clínico de anticorpos. Tentar tornar o ensaio monócito-macrófago mais fácil de usar, mais rápido e sem necessidade de microscopia de luz, mas talvez um mecanismo automatizado para ler a fagocitose seja desejável.
Para começar, dilua o sangue total com o meio completo RPMI-1640 e coloque-o em um meio de gradiente de densidade para centrifugação. Após a centrifugação, recupere o revestimento leucocitário contendo células mononucleares do sangue periférico ou PMBCs. Após a peletização dos PBMCs obtidos, ressuspenda-os em 10 mililitros de meio completo RPMI-1640 pré-aquecido.
Determine o número de células usando equipamento apropriado antes de iniciar o processo de isolamento de monócitos. Siga as instruções do kit de isolamento de monócitos e transfira a amostra para um tubo de propileno de tamanho apropriado. Adicionar o cocktail de enriquecimento à amostra a uma concentração de 50 microlitros por mililitro da amostra.
Depois de pipetar a amostra para cima e para baixo, vórtice-a para misturar completamente e incubar a amostra a dois a oito graus Celsius por 10 minutos em um balde de gelo. Agora, vortex as partículas magnéticas por 30 segundos durante este período de incubação. Após a incubação, adicione partículas magnéticas à amostra a uma concentração de 100 microlitros por mililitro de amostra.
Vortex a amostra e incube-a a dois a oito graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione o meio de isolamento para completar o volume para 2,5 mililitros ou 10 mililitros conforme necessário, usando uma pipeta graduada e misture. Em seguida, coloque o tubo de propileno sem tampa no ímã e incube em temperatura ambiente por cerca de 2,5 minutos.
Em seguida, pegue o ímã e invertado em um movimento contínuo para despejar a suspensão da célula em um novo tubo de 5 ou 14 mililitros. Ressuspenda as células isoladas no meio RPMI-1640. Para começar, adicione cinco mililitros de solução de poli-D-licina a um frasco de 25 mililitros para cada população de macrófagos, M1 e M2, e deixe os frascos no exaustor por pelo menos uma hora.
Depois de determinar a contagem de células, adicione cinco mililitros de meio RPMI-1640 e, em seguida, semeie entre uma a cinco vezes, 10 elevado à potência de seis monócitos em cada frasco pré-codificado de 25 mililitros. Incubar o balão a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante pelo menos duas horas. Após o período de incubação, lave o frasco uma vez com PBS e duas vezes com o meio RPMI-1640 completo.
Adicione 10 mililitros de meio de diferenciação M1 ou M2 ao frasco de acordo com o tipo de célula desejado e deixe as células se diferenciarem na incubadora por seis dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No sexto dia, adicionar cinco mililitros de meio de polarização M1 ou M2 a cada frasco, conforme necessário. Deixe os macrófagos polarizarem na incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos dois dias.
Antes de colher macrófagos M1 ou M2 no oitavo dia, colete o sobrenadante em um tubo de 15 mililitros para uso posterior, se necessário. Adicionar um mililitro de solução de desprendimento de células ao balão e incubar. Para interromper a reação, adicione três mililitros de meio RPMI-1640 completo ao frasco e colete a mídia em um tubo de 15 mililitros.
Depois de adicionar mais três mililitros de meio ao frasco, use um raspador de células para separar as células do fundo. Recolher as células separadas num novo tubo de 15 mililitros. Para determinar a qualidade dos macrófagos M1 e M2, lave as células duas vezes com PBS e ressuspenda em meio RPMI-1640 completo a 0,5 vezes, 10 elevado a seis células por tubo.
Em seguida, analise as duas populações de células usando um ensaio de citometria de fluxo. Conte os macrófagos M1 e M2 obtidos usando um hemocitômetro em uma proporção de coloração de um para um com azul de tripano. Reconstitua os macrófagos a uma concentração de 1 vezes 10 elevado a seis células por mililitro em meio completo RPMI-1640.
Usando uma micropipeta, semeie 400 microlitros da suspensão celular em cada poço da lâmina da câmara de oito poços e incube a lâmina a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos 1,5 horas em uma incubadora de cultura de tecidos totalmente umidificada. Para lavar as hemácias R2R2 positivas para RhD, adicione PBS a pH 7,4 às células e centrifugue a amostra a 350 G por cinco minutos. Após mais duas lavagens, opsonize a amostra de hemácias de teste com anticorpos de interesse.
Incube as hemácias opsonizadas e não opsonizadas de anticorpos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Vórtice intermitentemente a cada 15 minutos para evitar que os eritrócitos se assentem. Em seguida, lave as hemácias opsonize três vezes com PBS em pH 7,4, conforme demonstrado anteriormente.
Para verificar a opsonização de hemácias, realize um teste de antiglobulina indireta com um anticorpo anti-humano opsonizante secundário para o anticorpo opsonizante primário. Depois de ler o teste de antiglobulina indireta, reconstitua RHD opsonizado lavado mais R2R2 RBCs em uma suspensão de 1,25% volume por volume com RPMI-1640 Complete Medium. Após a incubação de 1,5 horas dos macrófagos M1 e M2, aspirar e descartar o meio sobrenadante suavemente ao longo do canto do poço.
Em seguida, adicione 400 microlitros da mistura de hemácias 1,25% opsonizada a cada poço da configuração triplicada. Incube a amostra a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por duas horas sem perturbação. Agora despeje 100 mililitros de PBS em pH 7,4 em dois béqueres.
Mergulhe a corrediça no primeiro copo e mova-a para frente e para trás lentamente por 20 a 30 golpes. Em seguida, transfira a lâmina para o segundo copo e lave por 20 a 30 golpes. Remova a lâmina do PBS e enxugue o excesso de líquido em uma toalha de papel.
Mergulhe a lâmina em 100% de metanol por 45 segundos para fixar as células. Seque o slide ao ar e monte-o usando um meio de montagem preparado internamente. Adicionar lamínula e deixar a lâmina secar durante a noite antes da quantificação da fagocitose.
Os macrófagos M1 e M2 foram polarizados e cultivados com sucesso por oito dias com características morfológicas distintas observadas em imagens de microscopia. Na citometria de fluxo, os macrófagos M1 apresentaram cerca de 86,1% de expressão de CD80 e 0,17% de expressão de CD209. Os macrófagos M2 apresentaram 97,3% de expressão de CD209 e 0,003% de expressão de CD80.
Os histogramas de intensidade de fluorescência confirmaram maior expressão de CD80 em macrófagos M1 em comparação com macrófagos M2. Enquanto os macrófagos M2 apresentaram expressão de CD209 significativamente maior em comparação com os macrófagos M1. Os macrófagos M2 demonstraram um índice fagocítico significativamente maior em comparação com os macrófagos M1.
As imagens de microscopia mostraram evidências claras de aumento da fagocitose em macrófagos M2 em comparação com macrófagos M1. Este estudo teve como objetivo avaliar o potencial do uso de macrófagos em vez de monócitos para predizer a significância do anticorpo eritrocitário. Esta tabela mostra que os macrófagos M2 fagocitam melhor do que os macrófagos M1 ou monócitos com anticorpos considerados clinicamente significativos.
Assim, com um estudo mais aprofundado, um ensaio usando macrófagos M2 pode ser usado para melhor previsão do significado clínico do anticorpo.
