Nossa pesquisa se concentra principalmente na conexão entre o reparo do DNA e o envelhecimento. Especificamente, analisamos diferentes distúrbios da laminopatia e queremos aprender como eles podem afetar o reparo do DNA. Demonstramos que um distúrbio de laminopatia associado ao envelhecimento prematuro e a uma curta expectativa de vida conhecida como síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford está realmente associado a um aumento da quantidade de danos ao DNA e reparo impreciso do DNA.
Nosso laboratório gostaria de investigar o efeito de terapias potenciais para pacientes com laminopatia para saber se essas abordagens também terão um impacto positivo no reparo e dano ao DNA. Para começar, coloque uma lamínula em cada poço de uma placa estéril de 6 poços usando uma pinça. Adicione dois mililitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium suplementado, ou DMEM, a cada poço na placa de 6 poços.
Aspirar os meios das células HeLa cultivadas no balão e lavar as células adicionando 15 mililitros de PBS. Agite o frasco suavemente para lavar as células, aspire o PBS e adicione dois mililitros de tripsina-EDTA para revestir as células. Coloque o frasco revestido com tripsina em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois minutos para permitir que as células se desprendam.
Em seguida, adicione oito mililitros de DMEM suplementado ao frasco contendo as células tripsinizadas e pipete para cima e para baixo várias vezes para separar as células aglomeradas. Recolher a suspensão celular do balão para um tubo de poliestireno de 15 mililitros. Depois de contar as células, adicione 500.000 células, gota a gota, diretamente em cada uma das lamínulas na placa de 6 poços.
Coloque a placa em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono para permitir que as células cresçam durante a noite. Para fixação celular, aspire o meio dos poços da placa de 6 poços no dia seguinte. Adicione dois mililitros de PBS a cada poço para lavar as células e aspirar completamente todo o PBS dos poços.
Em seguida, adicione dois mililitros de solução de formaldeído a 4% em cada poço por 10 minutos em temperatura ambiente e aspire a solução completamente dos poços. Em seguida, adicione dois mililitros de solução de permeabilização a cada poço. Deixe a solução descansar por 10 minutos em temperatura ambiente e aspire-a completamente.
Lave as células três vezes com dois mililitros de PBS em cada poço. Aspire completamente após cada lavagem. Depois que todo o PBS for aspirado dos poços, adicione dois mililitros de tampão diluente de anticorpos, ou ADB, a cada poço para bloquear as células para coloração por imunofluorescência.
Incube em temperatura ambiente por 30 minutos com agitação orbital suave. No final do período de bloqueio. Prepare a diluição do anticorpo primário misturando o lúmen B1 e anticorpos de DNA de fita dupla no ADB.
No final da incubação, aspire o ADB dos poços. Cole um pedaço de filme de parafina em uma superfície plana, garantindo que a área seja grande o suficiente para acomodar todas as lamínulas que estão sendo processadas. Para cada lamínula, pipetar 75 microlitros da diluição do anticorpo primário sobre o filme de parafina, evitando bolhas.
Usando uma pinça, coloque cada célula de lamínula voltada para baixo na gotícula de anticorpos. Cubra as lamínulas de incubação com a tampa da placa de 6 poços e deixe as lamínulas incubarem por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, usando uma pinça, remova cuidadosamente as lamínulas do filme de parafina e coloque-as de volta na placa de 6 poços com o lado da célula voltado para cima.
Lave as lamínulas agitando-as três vezes por cinco minutos com dois mililitros de PBST. Durante a lavagem final, preparar a diluição do anticorpo secundário. Após a última lavagem, aspire PBST completamente.
Adicione o anticorpo secundário ao filme para e coloque as lamínulas no filme de parafina, com a célula voltada para baixo. Em seguida, coloque uma capa protetora leve sobre as lamínulas para proteger as células da luz e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Usando uma pinça, remova cuidadosamente as lamínulas do filme de parafina e coloque-as de volta na placa de 6 poços, garantindo que o lado da célula esteja voltado para cima, Em seguida, desidrate as lamínulas adicionando sequencialmente dois mililitros de 70% 90% e 100% de etanol aos poços, permitindo que cada solução permaneça por um a dois minutos antes da remoção.
Usando uma pinça, remova as lamínulas dos poços e coloque-as em um pano sem fiapos para secar ao ar, protegido da luz. Monte as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo nas lâminas do microscópio de vidro usando 20 microlitros de meio de montagem por lamínula. A bolha nuclear foi mais prevalente em células knockout de ZMPST24 HeLa, com aproximadamente 50% dos núcleos exibindo bolhas, em comparação com 17% nas células de controle HeLa.
O vazamento de DNA foi observado predominantemente em células knockout ZMPSTE24 HeLa, enquanto nenhum vazamento de DNA foi observado em células controle HeLa, o vazamento de DNA ocorreu em algumas células knockout ZMPSTE24, mesmo na ausência de blebbing nuclear visível.
