免疫荧光检测哺乳动物细胞中的核泡和 DNA 泄漏

我们的研究主要集中在 DNA 修复与衰老之间的联系。具体来说，我们研究了不同的椎板病疾病，我们想了解它们如何影响 DNA 修复。我们已经证明，与过早衰老和短寿相关的椎板病疾病，称为 Hutchinson-Gilford 早衰综合症，实际上与 DNA 损伤量增加和 DNA 修复不精确有关。

我们实验室想研究潜在疗法对椎板病患者的影响，以了解这些方法是否也会对 DNA 修复和 DNA 损伤产生积极影响。首先，使用镊子将一个盖玻片放入无菌 6 孔板的每个孔中。向 6 孔板中的每个孔中加入 2 毫升补充的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基或 DMEM。

从培养瓶中培养的 HeLa 细胞中吸出培养基，并加入 15 毫升 PBS 洗涤细胞。轻轻旋转培养瓶以洗涤细胞，吸出 PBS，并加入 2 毫升胰蛋白酶-EDTA 以包被细胞。将涂有胰蛋白酶的培养瓶置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳加湿的培养箱中 2 分钟，让细胞分离。

然后将 8 毫升补充的 DMEM 添加到含有胰蛋白酶消化细胞的培养瓶中，并上下移液数次以分离聚集的细胞。将细胞悬液从培养瓶中收集到 15 mL 聚苯乙烯管中。细胞计数后，将 500， 000 个细胞逐滴直接添加到 6 孔板的每个盖玻片上。

将板放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳加湿培养箱中，让细胞生长过夜。对于细胞固定，第二天从 6 孔板的孔中吸出培养基。向每个孔中加入 2 毫升 PBS 以洗涤细胞并从孔中完全吸出所有 PBS。

然后在室温下向每个孔中加入 2 毫升 4% 甲醛溶液 10 分钟，并从孔中完全吸出溶液。接下来，向每个孔中加入 2 毫升透化溶液。让溶液在室温下静置 10 分钟，然后完全吸出。

用每孔 2 毫升 PBS 洗涤细胞 3 次。每次洗涤后充分吸液。从孔中吸出所有 PBS 后，向每个孔中加入 2 mL 抗体稀释缓冲液或 ADB，以封闭细胞进行免疫荧光染色。

在室温下孵育 30 分钟，轻轻摇动眼圈。在阻止期即将结束时。通过在 ADB 中混合内腔 B1 和双链 DNA 抗体来制备一抗稀释液。

在孵育结束时，从孔中吸出 ADB。在平坦的表面上用胶带粘上一块石蜡膜，确保该区域足够大，以容纳所有正在处理的盖玻片。对于每个盖玻片，将 75 微升一抗稀释液移液到石蜡膜上，避免任何气泡。

使用镊子将每个盖玻片细胞面朝下放在抗体液滴上。用 6 孔板的盖子盖住孵育盖玻片，让盖玻片在室温下孵育 1 小时。然后用镊子小心地从石蜡膜上取下盖玻片，并将它们放回 6 孔板中，细胞面朝上。

用 2 毫升 PBST 摇动盖玻片 3 次，持续 5 分钟，清洗盖玻片。在最终洗涤过程中，准备二抗稀释液。最后一次洗涤后，完全吸出 PBST。

将二抗添加到旁膜中，并将盖玻片放在石蜡膜上，细胞面朝下。然后在盖玻片上盖上一层薄薄的保护罩，以保护细胞避光，并在室温下孵育 30 分钟。使用镊子小心地从石蜡膜上取下盖玻片，并将其放回 6 孔板中，确保细胞侧朝上，然后依次向孔中加入 70%90% 和 100% 乙醇各两毫升，使盖玻片脱水，让每种溶液静置一到两分钟，然后再取出。

使用镊子从孔中取出盖玻片，将它们放在无绒湿巾上避光风干。将盖玻片细胞面朝下安装在玻璃显微镜载玻片上，每个盖玻片使用 20 μL 封固剂。细胞核起泡在 HeLa ZMPST24 敲除细胞中更为普遍，大约 50% 的细胞核出现细胞泡，而 HeLa 对照细胞中为 17%。

DNA 泄漏主要在 HeLa ZMPSTE24 敲除细胞中观察到，而在 HeLa 对照细胞中未观察到 DNA 泄漏，DNA 泄漏发生在一些 ZMPSTE24 敲除细胞中，即使没有可见的核起泡。