Minha pesquisa se concentra principalmente na eletrofisiologia cardiovascular. Este estudo descreve um método para isolar células musculares vasculares primárias e utilizar a tecnologia de pinça de célula inteira para auxiliar suas propriedades eletrofisiológicas. O isolamento de células frescas tem limitações, como o impacto da temperatura na separação enzimática, tempos de digestão variáveis para diferentes vasos sanguíneos e capacidade instantânea no ambiente nativo das células.
Além disso, a tecnologia de grampo de aperto apresenta desafios na ruptura de tetos e membranas que requerem operação especializada. Este protocolo facilita a pesquisa na aquisição imediata de células primárias ativas das artérias manuais e deve rapidamente tocar a aplicação da técnica de pinça. Para começar, encha uma placa de Petri com solução salina fisiológica fria saturada com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.
Coloque um cérebro de rato isolado na placa de Petri. Posicione o cérebro ventralmente para cima na placa de Petri e prenda-o com agulhas. Sob um microscópio óptico, localize a artéria basilar.
Com autoclave, pinça e tesoura, remova cuidadosamente o tecido circundante. Em seguida, insira um fio de dois centímetros de comprimento com um diâmetro de 25 micrômetros na artéria basilar isolada. Esfregue suavemente a parede interna da artéria com o fio para remover efetivamente o endotélio vascular.
Para isolar as células musculares lisas, primeiro pré-aqueça as soluções nos tubos de ensaio um a três. Transfira a artéria basilar isolada para o tubo de ensaio dois. Incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos enquanto injeta continuamente uma mistura de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono no tubo.
Em seguida, transfira a artéria basilar do tubo de ensaio dois para o tubo de ensaio três e incuba. Transfira um mililitro de solução de separação de células pré-aquecidas do tubo de ensaio um para o tubo de ensaio três. Continue injetando 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono, mantendo o tratamento enzimático por três minutos.
Triturar a preparação da artéria basilar para liberar células. Em seguida, pipete quatro mililitros de solução de separação a frio para o tubo de ensaio três para encerrar o processo enzimático. Centrifugar a mistura a 59 g durante seis minutos.
Com uma pipeta, descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione a solução de separação a frio novamente. Após a última lavagem, remova o sobrenadante.
Deixe um mililitro da suspensão celular. Armazene a suspensão celular a quatro graus Celsius por seis a oito horas. Transfira 100 microlitros da suspensão celular para um banho.
Adicione um mililitro de fluido extracelular ao banho e deixe descansar. Para começar, ligue um micropipeta polar. Coloque um tubo de vidro no polar.
No painel de controle, selecione o programa um. Clique em entrar e acesse o programa um. Agora execute um teste de rampa clicando em rampa no painel de controle para medir o valor calorífico do tubo de vidro.
Insira um novo tubo de vidro. Em seguida, selecione o programa um e clique em Enter para fabricar a micropipeta. Para registrar a corrente de atendimento, primeiro inicie o software de aquisição de dados.
Selecione o arquivo e clique em definir nomes de arquivos de dados para estabelecer um caminho de armazenamento de dados. Ative a função de teste de membrana no menu de ferramentas. Coloque uma amostra de células musculares lisas isoladas da artéria basilar de um rato no centro da visão da câmera de um microscópio.
Mergulhe a ponta do fio de referência na solução de banho. Em seguida, encha 20% da micropipeta fabricada com a solução intracelular. Prenda a micropipeta carregada no suporte do eletrodo de gravação.
Agora, com uma seringa, aplique pressão positiva. Mova a ponta da pipeta para a solução de banho e ajuste o deslocamento da pipeta no sinal amplifier software para definir a linha de base atual para zero picoamperes. Pressione suavemente a pipeta contra a membrana celular.
Observe um aumento na resistência da vedação a pelo menos um magome. Remova a pressão positiva e aplique pressão negativa. Para estabelecer alta resistência, com uma resistência de vedação de pelo menos um giggome, defina a tensão de retenção para menos 60 milivolts e compense a capacitância do eletrodo usando CP FAST e CP slow.
Aplique uma breve pressão negativa para romper a membrana celular, formando uma configuração de célula inteira. Selecione a célula inteira no sinal amplifier software. Em seguida, clique em auto para compensação de capacitância da membrana.
Carregue o protocolo kir e comece a gravar os dados. Células musculares lisas recém-isoladas com morfologia fusiforme foram isoladas. As células eram saudáveis e adequadas para experimentos com patch clamp.
Uma corrente de cura típica exibiu retificação interna em tensões negativas com fluxo mínimo ou nenhum fluxo de corrente de íons de potássio em tensões positivas. O cloreto de bário em concentrações de 100 a 300 micromoles por litro inibiu efetivamente a atividade do canal kir, confirmando a corrente como kir. O nitroprussiato de sódio aumentou a corrente kir, indicando o papel dos canais kir na vasodilatação induzida por SNP.
A comparação das relações de tensão de corrente demonstrou uma diminuição na densidade de corrente na presença de cloreto de bário e um aumento com SNP.
