Este protocolo pode ser utilizado para avaliar o impacto de mutações genéticas na função das fibras musculares. Além disso, pode ser usado para estudos de triagem de drogas que visam melhorar a saúde muscular. Esta técnica pode ser usada para isolar e medir a contratilidade em um grande número de fibras musculares em um período relativamente curto de tempo, sem a necessidade de treinamento avançado.
A composição dos hidrogéis pode ser alterada para atestar o efeito de pistas ambientais em músculos saudáveis e doentes. A parte mais desafiadora do procedimento é a dissecção inicial do músculo. Se não forem tomados cuidados suficientes, danos ao músculo podem levar a uma diminuição da viabilidade das fibras musculares.
Quem demonstrará o procedimento serão Leander Vonk, técnico de pesquisa, e Osman Esen, doutorando em meu laboratório. Comece cortando a perna traseira inferior do rato eutanasiado logo acima do tornozelo. Faça uma incisão na pele do lado dorsal do pé em direção aos dedos dos pés.
Descasque cuidadosamente a pele em direção aos dedos dos pés tomando cuidado para não danificar o músculo. Coloque o pé dissecado em uma placa de vedação contendo 10 mililitros de meio de dissecção pré-aquecido a 37 graus Celsius. Fixe o pé através da pele ainda presa aos dedos dos pés.
Fixe a perna além do tornozelo e excise cuidadosamente o tecido conjuntivo na parte superior do músculo. Corte o tendão no calcanhar e levante o músculo. Corte ao lado e por baixo do músculo através do tecido conjuntivo até que os tendões dos dedos dos pés estejam expostos.
Corte os tendões quando a metade do comprimento de três tendões estiver exposta. Solte o músculo do pé e fixe os tendões dos músculos FDB. Remova qualquer tecido conjuntivo restante do músculo.
Transfira o tecido muscular limpo para um tubo contendo meio de dissecção pré-aquecido. Use uma pipeta sorológica para transferir o músculo curto para um tubo contendo o meio de digestão muscular. Coloque o tecido em uma incubadora a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono por 80 minutos.
Transfira o músculo para um tubo de 15 mililitros contendo três mililitros de meio de dissecção. Usando pontas de trituração preparadas, pipetar o músculo indo do maior para o menor e continuar a trituração até que as fibras musculares tenham saído do tendão. Os tendões podem ser removidos com uma ponta P200.
Transfira as fibras musculares dissociadas para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de dissecção. Deixe as fibras se depositarem na incubadora por 20 minutos até formar um pellet. Pipetar cuidadosamente todo o meio a partir do topo do pellet de fibra.
No gelo, ressuspenda as células em 875 microlitros de mistura celular por músculo. Adicione 125 microlitros de mistura de células de matriz em tubos contendo 125 microlitros de alíquota de suspensão de células. Misture por pipetagem suave, evitando a formação de bolhas.
Transfira a mistura final imediatamente para um poço. Verificar a viabilidade das fibras musculares ao microscópio. Coloque os géis em uma incubadora por 30 a 45 minutos para promover a solidificação.
Uma vez feito, adicione cuidadosamente 500 microlitros de meio de cultura em cada poço. Ligue o sistema de medição contrátil baseado em óptica, a lâmpada fluorescente, o pacer de célula elétrica e o computador. Ajuste o estimulador elétrico para 1,0 hertz a 10 volts com duração de pulso de cinco milissegundos para estimular as fibras musculares isoladas.
Insira a placa no sistema de medição. Conecte o pacer à pastilha e insira-o na placa de cultura. Abra o programa IonWizard.
Clique em OK. Abra um novo arquivo clicando no ícone Arquivo e, em seguida, clique em Novo. Selecione Coletar experimento para verificar se o programa está no sarcomere esquelético do experimento correto. Para alterar o experimento, clique no experimento desejado e pressione Adicionar.
Aplique as configurações SARC 20X, linhas médias, FFT simples, taxa de amostragem de 250 hertz e um tempo de aquisição de 10 segundos. Altere a temperatura do sistema de medição para 25 graus Celsius. Clique no localizador de celular aberto para criar um novo pop-up de tela.
Selecione Tipo de placa e Poços ativos. Concentre as fibras ajustando a barra deslizante de foco. Permitir que a estimulação induza a estimulação elétrica e observe a contração das fibras.
Mantendo os sarcômeros em foco, certifique-se de que a área de medição esteja fixada na extremidade da fibra de modo que os sarcômeros corram verticalmente. Quando os sarcômeros estão focados, um único pico é visível na barra de ferramentas que se moverá para a direita após a contração. Meça as fibras no sistema de medição.
Clique em Iniciar para iniciar o experimento. Pressione a tecla Q para começar a medir 10 transientes de contração. Se mais de quatro transientes parecerem livres de ruído, aceite a medição pressionando a tecla Z.
Se os transientes contiverem muito ruído, rejeite as medições. Pressione Parar para fechar a janela do localizador de células assim que o experimento for concluído. Salve o arquivo e crie um novo arquivo.
Abra o programa CytoSolver desktop, clique em Importar e selecione os arquivos a serem analisados. Quando a análise estiver concluída, identifique os picos azul, vermelho e cinza. Clique em Exportar.
Selecione as caixas intituladas Média para Dados Transitórios e exporte para o Excel. Uma maior porcentagem de medidas contráteis utilizáveis do músculo foi obtida no hidrogel de fibrina 3D, uma vez que impediu movimentos laterais e outros fatores de influência. A incorporação de fibras não teve efeito significativo sobre a velocidade máxima de contração ou o encurtamento do sarcômero.
Contração reduzida na matriz basal pura foi observada provavelmente devido à rigidez do gel ou aumento da interação da matriz celular. Da mesma forma, a incorporação da matriz basal também reduziu o encurtamento do sarcômero em comparação com o hidrogel de fibrina. É importante lembrar que as fibras musculares isoladas são bastante frágeis e deve-se tomar cuidado extra para não danificá-las durante a pipetagem.
Após o procedimento de isolamento, métodos como imunomarcação, isolamento de proteínas e RNA também podem ser realizados. O desenvolvimento dessa técnica abriu novas possibilidades para o estudo da função das fibras musculares maduras de forma de alto rendimento.
