Geração de camundongos knockout específicos para gordura marrom usando um sistema combinado de RNA guia único Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado

Este protocolo gera camundongos knockout fat-specific marrom usando um sistema de RNA guia único Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e adenoassociado. Inclui uma técnica cirúrgica para administrar com segurança o AAV na gordura marrom. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode gerar rapidamente knockouts tecido-específicos sem a necessidade de criar camundongos seletivamente.

A abordagem para fazer knockout ou knockdowns específicos do tecido pode ser adaptada a outros tecidos se o procedimento cirúrgico para injetar AAV for modificado com base no órgão-alvo. Para começar, administrar o analgésico por via subcutânea no camundongo UCP1 Cre Cas9 anestesiado para minimizar e prevenir a dor e o sofrimento pós-operatórios. Em seguida, raspar o pelo em sua área interescapular com um barbeador e esterilizar a área cirúrgica com pelo menos três rodadas alternadas de um esfoliante à base de iodo ou clorexidina, seguido de etanol a 70%.

Usando um bisturi, faça uma incisão de dois centímetros na pele acima do tecido adiposo marrom entre as escápulas para expor a gordura interescapular. Após fazer uma única incisão, cortar os tecidos adiposos na borda entre a região distal dos tecidos adiposos e os músculos. Em seguida, usando a tesoura cirúrgica na mão dominante, descasque os tecidos gordurosos bruscamente e verticalmente para expor o tecido adiposo marrom enquanto belisca os tecidos adiposos, incluindo o tecido adiposo marrom, com a mão não dominante.

Use a veia de Sulzer como um ponto de referência para indicar a localização precisa do tecido adiposo marrom. Em seguida, para cada camundongo, injete 20 microlitros de vírus adenoassociado ou AAV lentamente em cada lóbulo dos dois tecidos adiposos marrons usando uma agulha afiada de calibre 32 conectada a uma seringa Hamilton de 100 microlitros. Confirme se a injeção bem-sucedida não tiver vazamentos do local injetado durante a administração de AAV.

Depois de garantir a homeostase, coloque os tecidos adiposos expostos de volta em sua posição normal para suturar a borda dos tecidos adiposos e do músculo usando um fio monofilamentar absorvível 5-0. Finalmente, suture a pele aberta com fios trançados não tingidos VICRYL 5-0. A localização precisa do tecido adiposo marrom não pode ser identificada sem expô-lo, no entanto, danos de exposição excessiva ao tecido.

As possíveis falhas que podem ter levado a injeções malsucedidas incluíram a injeção da solução de AAV na região incorreta, penetração da agulha através do tecido e balonamento tecidual devido a um volume excessivo da solução de AAV. A entrega precisa do RNA guia único do AAV para o tecido adiposo marrom foi crucial para o sucesso do protocolo. A chave para o sucesso durante a exposição do tecido adiposo marrom é a técnica cirúrgica de tesoura, incluindo a direção e profundidade da tesoura e a localização da seringa de Hamilton.

Esta técnica tem um nocaute tecido-específico gerador de carga animais para entender os reguladores moleculares do metabolismo energético relacionado à gordura marrom.