Este protocolo descreve um método para medir o controle mecânico do relaxamento ou a dependência de esforço do relaxamento muscular na trabécula cardíaca. A principal vantagem dessa técnica é que ela foca no relaxamento cardíaco. Dada a falta de opções de tratamento para doenças diastólicas, essa técnica pode ser usada para identificar novos índices e alvos de drogas relacionados ao relaxamento cardíaco.
Este método será mostrado com um coração de roedor, mas pode ser usado em qualquer músculo intacto. Quem demonstrará esse procedimento será eu e Anita Abbo, assistente de iniciação científica do meu laboratório. Para começar, retire o coração do modelo de pequeno animal dissecado grosseiro da cânula e coloque-o em uma placa de pesagem revestida de elastômero de silicone para se preparar para o isolamento trabecular.
Em seguida, coloque e ilumine o coração sob um microscópio estéreo. Após a localização da via de saída do ventrículo direito, fixe o átrio esquerdo e o ápice ventricular no elastômero de silicone na placa. Com tesoura longa de Vannas, cortado da via de saída do ventrículo direito até o ápice ao longo do septo.
Em seguida, corte da via de saída do ventrículo direito para o átrio direito, próximo à aorta, e então corte o átrio direito. Com o uso de pinças, abra cuidadosamente a parede livre do ventrículo direito da via de saída sem esticar o tecido. Os fios de tecido conjuntivo fino branco, se encontrados, podem ser cortados, mas não os fios de tecido rosa maiores, pois podem ser trabéculas.
Fixe a parede livre do triângulo do ventrículo direito na placa para expor o ventrículo direito. Usando uma pipeta de vidro fundido fina e romba, procure trabéculas independentes no endocárdio exposto sem aplicar pressão. Evitar os músculos papilares triangulares e selecionar trabéculas com lados paralelos, que são frequentemente encontradas perto da base da parede livre do ventrículo direito e ao longo do septo.
Dissecar a trabécula usando uma pequena tesoura de Vannas, deixando um pedaço de tecido de um milímetro cúbico em cada extremidade da trabécula para permitir a fixação. Em seguida, corte aproximadamente dois centímetros da extremidade de uma pipeta de transferência de sete mililitros, desenhe lentamente a trabécula para dentro da pipeta e transfira-a para uma nova placa de pesagem, contendo solução de perfusão a 50% e solução de Tyrode modificada a 50%. Deixe o músculo se equilibrar para o aumento do cálcio extracelular dentro da solução mista por vários minutos.
Desligue a bomba que fornece superfusão ou sucção para a câmara experimental. Usando a pipeta de transferência de furo grande, mova a trabécula para a câmara experimental preenchida com a solução de Tyrode. Fixe um pedaço de tecido em cubos na extremidade da trabécula em um gancho no transdutor de força e, em seguida, fixe o segundo cubo no motor.
Reinicie a superfusão e comece a marcar o músculo para determinar a tensão limiar. Ritmo a 20% acima da tensão limite por aproximadamente uma hora. Ao final desse período de equilíbrio, alongar lentamente o músculo utilizando o micrômetro conectado ao motor, até que se atinja a geração ótima de tensão desenvolvida pela observação da tensão desenvolvida.
Pare de aumentar o comprimento muscular quando a tensão diastólica passiva aumenta mais rápido do que o pico de tensão, indicando que o comprimento ideal foi ultrapassado. Desligue a iluminação do microscópio transmitido e ilumine a trabécula usando um iluminador de pescoço de ganso em um ângulo íngreme. Usando uma câmera previamente calibrada conectada através da óptica do microscópio, capture uma imagem da trabécula durante a diástole para dentro da pasta experimental.
Faça a média das medidas de diâmetro e converta o diâmetro e o comprimento de pixels em milímetros usando uma calibração previamente obtida. Calcular a área de secção transversa e o comprimento muscular em micrômetros. No software de aquisição de dados, adquira dados de fixação de carga definindo a pós-carga no arquivo dap e itere valores de ganho proporcional e parâmetros de integração salvando o arquivo no editor de texto e, em seguida, pressione "Executar experimento" na interface.
Controle a extremidade da braçadeira de carga alterando o modo. Repita a aquisição enquanto altera a extremidade da braçadeira de carga de zero para completa, realongando de volta para o comprimento inicial. Para aumentar o comprimento, aumente incrementalmente o limiar para terminar a pinça de carga de zero até que o músculo quase volte ao seu comprimento original.
Se desejar, modifique a pós-carga e repita a aquisição imediatamente. Se desejar, modifique a pré-carga alongando ou encurtando o músculo, ou trate o músculo adicionando compostos à solução de Tyrode, mas aguarde um mínimo de 20 minutos para garantir que a resposta de força lenta tenha se estabilizado e para que o composto penetre totalmente no músculo. Uma vez concluída a aquisição de dados, remova as trabéculas e limpe o sistema experimental.
Quantifique o relaxamento garantindo que o programa de análise de dados analise a batida de fixação e que o programa adquira corretamente o início da braçadeira de carga. Depois de quantificar todos os traços de uma determinada condição, plote a relação entre a taxa de relaxamento e a taxa de deformação, limitando os dados máximos a uma taxa de deformação fisiológica inferior a um por segundo. Exclua dados com baixas taxas de deformação, pois a fase de relaxamento pode não refletir o decaimento exponencial.
Obter a inclinação da linha entre a taxa de relaxação e a taxa de deformação, e registrar a inclinação como índice de controle mecânico de relaxação. Uma única trabécula cardíaca iluminada usando uma luz LED de pescoço de ganso em um ângulo íngreme de 75 graus em relação ao eixo da lente do microscópio é mostrada aqui. As curvas de tempo de tensão e tempo de deformação para uma mesma trabécula mostraram contração isométrica e três contrações de clamp de carga nas taxas de deformação sistólica e crescente.
A taxa de deformação é calculada a partir da derivada da deformação imediatamente anterior ao relaxamento isométrico. Os dados são plotados em um gráfico de taxa de relaxação versus taxa de deformação, onde a inclinação da linha fornece o controle mecânico de relaxação, ou índice MCR. O componente mais difícil desse protocolo é o isolamento cuidadoso da trabécula cardíaca.
Esse protocolo pode ser combinado com outras medidas musculares, incluindo cálcio intracelular, contratilidade e comprimento do sarcômero. Além disso, esse método está sendo usado para identificar mecanismos moleculares e entender melhor a fisiopatologia do relaxamento cardíaco prejudicado.
