Este protocolo é significativo, pois mostra loops cromossômicos de alta resolução e outros recursos de interação de curto alcance. A principal vantagem desta técnica é o mapeamento da organização do genoma 3D com resolução nucleossômica com alta relação sinal-ruído. Para realizar a titulação da MNase, descongelar uma pastilha de uma vez 10 até a sexta célula sobre gelo por 10 minutos, ressuspender as células em 500 microlitros de DPBS e incubar a suspensão celular em gelo por 20 minutos.
Recolher as células por centrifugação a 10 000 G durante cinco minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Ressuspenda as células peletizadas em 500 microlitros de buffer MB Número um. Descongelar um frasco de 20 unidades por microlitro de MNase e diluí-lo com Tris 10 milimolares para as condições de digestão descritas no texto.
Com intervalos de tempo apropriados de 10 a 20 segundos, adicione um microlitro da primeira solução de digestão de MNase a um dos tubos das quatro amostras, vortex e incube em um ThermoMixer a 37 graus Celsius por 10 minutos a 800 RPM. Continue adicionando um microlitro das diluições de MNase restantes às outras alíquotas celulares. Pare a digestão da MNase adicionando 200 microlitros de tampão de parada recém-preparado a cada tubo na mesma ordem e no mesmo intervalo de tempo em que a MNase foi adicionada.
Incubar a 65 graus Celsius por duas horas. Adicione 500 microlitros de PCI a cada amostra e misture bem por vórtice. Centrifugar a 19, 800 G por cinco minutos à temperatura ambiente para separar as fases.
E transferir a fase aquosa para novos tubos. Purificar o DNA usando um kit comercial de purificação de DNA de acordo com as instruções do fabricante e eluir as amostras em 12 microlitros de tampão de eluição. Adicione dois a cinco microlitros de corante de carga à amostra de DNA purificada.
Execute as amostras em um gel de agarose a 1,5% e escolha o melhor grau de digestão para o experimento. Um grau ótimo de digestão exibe pouco ou nenhum fragmento subnucleossomal, e uma proporção de 70 a 90% mono para dinucleossomo. Nesta amostra representativa, um grau intermediário de digestão entre as pistas três e quatro foi selecionado para os experimentos de acompanhamento.
Com base na titulação da MNase, digerir a cromatina adicionando a quantidade adequada de MNase a cada alíquota da amostra. Misture bem e incube no ThermoMixer a 37 graus Celsius, 800 RPM por 10 minutos. Pare a digestão da MNase adicionando 1,6 microlitros de EGTA 0,5 molar a cada alíquota e incube em um ThermoMixer a 65 graus Celsius por 10 minutos com agitação de 800 RPM.
Recolher a amostra por centrifugação a 10 000 G durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante. Ressuspender o pellet de célula em 500 microlitros de tampão 1X NEB 2.1. Agrupar amostras equivalentes a uma entrada de cinco vezes 10 para a sexta célula ou menos para processamento posterior.
Antes de proceder à ligadura de proximidade, transfira 10% da amostra como controle de entrada para monitorar o nível de digestão da MNase. Adicione 150 microlitros de Tris 10 milimolares, 25 microlitros de SDS 10% e 25 microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K ao controle da digestão e incube durante a noite a 65 graus Celsius. Recolher a amostra restante por centrifugação a 10 000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet em 90 microlitros de Micro-C master mix one recém-preparado e incube em um ThermoMixer a 37 graus Celsius, 800 RPM por 15 minutos. Adicione 10 microlitros de cinco unidades por microlitro de fragmento de Klenow e incube em um ThermoMixer. Em seguida, adicione 100 microlitros de Micro-C master mix two recém-preparado.
Incubar por 45 minutos a 25 graus Celsius, 800 RPM, e extinguir a reação enzimática com EDTA conforme descrito no texto. Incubar em um Termomisturador por 20 minutos a 65 graus Celsius, 800 RPM. Recolher a amostra por centrifugação a 10 000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e eliminar o sobrenadante.
Ressuspender a amostra em 500 microlitros da mistura mestra Micro-C recém-preparada e incubar por 2,5 horas à temperatura ambiente de 15 a 20 RPM. Repita a centrifugação e remova o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda a amostra em 200 microlitros da mistura mestra Micro-C recém-preparada quatro e incube em um ThermoMixer regulado a 37 graus Celsius por 15 minutos a 800 RPM.
Para reticulação reversa e desproteinação, adicione 25 microlitros de 20 miligramas por microlitro de proteinase K e 25 microlitros de SDS 10% à amostra e incube a 65 graus Celsius durante a noite com mistura intermitente. Adicione 500 microlitros de PCI às amostras e controle de entrada, em seguida, misture por vórtice. Separe as fases por centrifugação a 19, 800 G por cinco minutos e transfira a fase aquosa superior para um tubo fresco.
Concentrar o DNA e eluir as amostras em 30 microlitros, e os controles de entrada em 15 microlitros. Execute um gel de agarose a 1,5% para separar os mononucleossomos e dinucleossomos. Excise os fragmentos de DNA que têm um tamanho dinucleossomal e extraia o DNA conforme descrito no texto.
Adicionar 150 microlitros de contas pré-preparadas a 150 microlitros da amostra e incubar à temperatura ambiente. Coloque os tubos em um ímã apropriado e aguarde até que a solução se limpe. Retire o sobrenadante e ressuspenda as contas em 300 microlitros de 1X TBW, e repita esta etapa.
Repita a separação magnética e, após a solução limpar, remova o sobrenadante e ressuspenda as esferas em 100 microlitros de TE0,1X TE. Repita e ressuspenda em 50 microlitros de 0,1X TE. Transfira a solução para tubos de PCR e realize a manipulação do DNA conforme descrito no texto. Após a ligadura do adaptador, lave a amostra em 1X TBW, descarte o sobrenadante e ressuspenda as esferas em 20 microlitros de 0,1X TE. Otimize o número de ciclos de PCR e amplie as bibliotecas de sequência conforme descrito no texto. Cromatina de 250.000 células por reação foi digerida com uma diluição de quatro vezes de MNase.
A maior concentração, 10 unidades, mostrou cromatina superdigerida quase exclusivamente consistindo de DNA mononucleossomal. A digestão de 250.000 células ES de camundongo com 0,625 unidades de MNase ofereceu o ponto de partida mais promissor para digestãos preparativas em experimentos de Micro-C. No entanto, uma concentração intermediária de MNase entre as condições mostradas nas faixas três e quatro, correspondendo a cinco unidades por 1 milhão de células, deve ser considerada.
A banda de mononucleossomos ligados por proximidade tinha um tamanho aproximado de 300 pares de bases, semelhante ao dos dinucleossomos. Portanto, a razão de sinal da banda mono para dinucleossomal mudou de predominantemente mononucleossomos para dinucleossomos. A qualidade e a quantidade da biblioteca de sequenciamento preparada foram avaliadas por PCR mínimo.
A visualização mostrou uma banda distinta em 420 pares de bases, e nenhuma banda para dímeros adaptadores. Enquanto ambas as amostras deste estudo apresentaram altas taxas de mapas, a amostra boa apresentou maior fração de leituras cis. Uma alta taxa de interações transcromossômicas indica eventos de ligadura aleatória, embora algumas interações transcromossômicas possam ser importantes.
Além disso, a boa amostra apresentou uma taxa moderada de pares de leitura de mapeamento reverso-reverso, com distâncias inferiores a 500 pares de base. Isso indicou uma baixa taxa de dinucleossomos não clivados pela MNase com tamanho semelhante a dois nucleossomos ligados por proximidade. Um grau adequado de digestão da MNase é crucial para este experimento.
Nucleossomos superdigeridos são ligados ineficientemente, e a cromatina subdigerida tem uma grande fração de dinucleossomos não digeridos que podem contaminar a biblioteca de sequenciamento. O Micro-C pode ser combinado com uma abordagem de captura para mapear a organização do genoma locus-específico com resolução enormemente alta.
