O objetivo geral deste protocolo é apresentar um método otimizado para o isolamento de hepatócitos em camundongos após hepatectomia parcial sem a necessidade de centrifugação por gradiente de densidade. Geralmente vemos uma grande porcentagem de hepatócitos carregados de lipídios durante a regeneração precoce. Os hepatócitos esteatóticos geralmente perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade devido à baixa densidade são mantidos com este protocolo.
Para preparar o equipamento de perfusão, conecte uma cânula IUI de calibre 26 à extremidade de saída da tubulação usando um conector de bloqueio Luer. Em seguida, lave a tubulação e insira a extremidade de entrada do tubo no tubo tampão de perfusão pré-aquecido no banho de água. Prime-o com tampão de perfusão quente a uma velocidade de bomba de três mililitros por minuto.
Antes de prosseguir com a cirurgia, certifique-se de que o rato está adequadamente anestesiado. Em seguida, limpe o abdômen com uma solução de esfoliação cirúrgica e etanol a 70%. Em seguida, corte as suturas para reabrir a incisão da linha média anteriormente feita para a hepatectomia parcial e puxe suavemente as bordas da ferida para longe.
Se a hepatectomia tiver mais de 24 a 48 horas, retire a sutura e corte a pele com tesoura ou bisturi. Use um afastador ou clipes simples para manter o abdômen aberto. A cavidade abdominal deve ser exposta o máximo possível para otimizar o acesso e a visualização.
Fixar uma sutura de polipropileno 5-0 no esterno. Puxe-o cranialmente e fixe-o nesta posição. Mova os intestinos para a direita usando cotonetes estéreis para revelar a veia porta e a veia cava.
Use um pano úmido para reter os intestinos. Coloque um objeto pesado de aproximadamente dois centímetros de altura, como um anel de peso de metal adjacente às patas traseiras do mouse. Em seguida, coloque a tubulação com a cânula IUI de calibre 26 conectada no objeto e posicione a agulha cuidadosamente em cima da veia cava.
Ajuste o comprimento da tubulação conforme necessário. Transfira a solução-mãe de colagenase para o tubo tampão de digestão pré-aquecido. Preparar 10 a 20 mililitros de tampão de digestão por animal.
Ligue a bomba depois de ajustar a velocidade da bomba para três mililitros por minuto. Descarte os primeiros dois a três mililitros do tampão de perfusão pré-aquecido assim que o tampão atingir a agulha. Para realizar a canulação da veia cava inferior, use um cotonete estéril para puxar suavemente a veia cava caudalmente abaixo da punção, de modo que a tensão fornecida facilite a inserção da cânula na veia.
Insira a cânula de IIU de calibre 26 em um ângulo raso na veia cava inferior abaixo do rim enquanto o tampão atravessa a agulha. Certifique-se de que o bisel da agulha aponte para cima. Procure sangue na câmara de flash do cateter quando a agulha entrar no lúmen.
Avance a agulha mais dois a três milímetros para garantir que a ponta do cateter entre na veia. Deslize o cateter plástico sobre a agulha e na veia cava mais cinco milímetros. Retire a agulha lentamente e com muito cuidado.
Após dois a três segundos, procure manchas brancas que se formam no fígado ou inchaço da veia porta, o que indica que o tampão de perfusão está fluindo através do fígado e entrando nos lóbulos hepáticos a partir da veia central. Espere que a veia porta inche visivelmente dentro de um a dois segundos de manchas brancas se formando na superfície do fígado. Corte a veia porta com uma tesoura o mais distalmente possível do hilo hepático.
Aumente a taxa de fluxo para quatro a sete mililitros por minuto, dependendo do peso do animal, do tamanho do fígado e da extensão da hepatectomia inicial. Campe a veia porta com uma pinça ou um grampo vascular por sete a 10 segundos. Certifique-se de que nenhum fluido esteja passando.
Realize um segundo grampo após aproximadamente 30 segundos e certifique-se de que o fígado incha e relaxa. Continue lavando o animal por três a quatro minutos e observe o tampão claro fluindo para fora da veia porta. Campe a veia porta por três a quatro segundos antes que o tampão de digestão atinja o fígado.
Certifique-se de que o fígado relaxa após a liberação do grampo e que o fluido de perfusão permanece claro. Uma vez que o tampão de digestão atinge o fígado, prenda a veia porta mais uma vez. O fígado não deve relaxar após a liberação do clampeamento.
Digerir por aproximadamente quatro minutos a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto. À medida que a digestão progride, procure sinais de que o fígado começa a inchar e pequenas seções transparentes na superfície do fígado. Observe que o fígado assume a textura de um pedaço de pano molhado e parece quase encharcado.
Sonde a consistência tocando-a cuidadosamente com um cotonete úmido e estéril. Continue com a perfusão até que uma diferença marcante na textura da superfície do fígado possa ser observada. Observe que o fígado assume uma cor muito clara e uma aparência borbulhante, indicando a cápsula de Glisson se separando do parênquima.
Pare a digestão assim que o fígado tiver adquirido essas propriedades. Remova a agulha antes que o ar entre no fígado. Segure o tecido conjuntivo central entre os lóbulos usando fórceps e levemente levante-o para cima usando-o como ponto de ancoragem.
Corte todas as conexões do fígado para outros órgãos e remova a vesícula biliar. Remova o fígado suavemente da cavidade abdominal. Tenha cuidado, pois será frágil e frágil nesta fase.
Coloque o fígado no tampão de preservação a frio. Transfira o fígado para uma placa de Petri de 10 centímetros e adicione 10 mililitros de Williams'Medium E.Break da cápsula de Glisson com pinças de ponta fina em alguns locais ao longo da superfície do fígado. Segure uma parte central com dois pares de pinças.
Separe-os lentamente, permitindo que a cápsula se rasgue sem danificar os hepatócitos e libere as células agitando suavemente a cápsula. Filtre cinco mililitros de polpa hepática através de um filtro de células de 100 micrômetros em um tubo de 50 mililitros. Lave o filtro com 10 mililitros de meio gelado fresco e filtre os restantes cinco mililitros de polpa através do filtro celular.
Gire o extrato a 50 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar a maior parte do sobrenadante, deixando um mililitro para ressuspender as células, girando suavemente o tubo. Adicione 40 mililitros de Williams'E Medium frio e repita o passo três vezes.
Proceder ao isolamento dos hepatócitos conforme descrito no manuscrito do texto. Após 70% de hepatectomia em camundongos, o rendimento final dos hepatócitos foi de aproximadamente 10 a 15 x 10 até o 6º com viabilidade final média de 78%. Enquanto após a hepatectomia prolongada de 86%, o rendimento de hepatócitos foi de quatro a nove x 10 até o 6º com viabilidade média de 65%.
Após hepatectomias parciais, os hepatócitos apresentam aumento do tamanho celular em relação aos fígados normais, correspondendo ao aumento do conteúdo lipídico. Observou-se aumento do conteúdo lipídico nos hepatócitos murinos 24 horas após a hepatectomia parcial, visto como aumento da granularidade ou diretamente observado pela presença de vesículas lipídicas no interior de hepatócitos aumentados. Usando o método clássico de purificação por gradiente de densidade, grandes hepatócitos gordurosos foram perdidos no sobrenadante e apenas hepatócitos menores magros são coletados na pelota celular.
Com o protocolo melhorado, os hepatócitos preenchidos com lipídios não foram perdidos e todos os hepatócitos foram peletizados. O aperto repetitivo facilita o processo de lavagem. Com isso, o fígado é otimamente limpo dos componentes sanguíneos restantes que poderiam inibir as enzimas de digestão.
