Modelos in vitro ou ex vivo anteriormente não possuem componentes celulares dérmicos e complexidade do tecido da pele. Este ensaio ex situ SCAD supera uma limitação definida e permite estudar o desenvolvimento de cicatrizes fora do animal ferido. O ensaio SCAD permite a visualização da migração do fibroblasto e da formação de cicatrizes em microambientes de pele.
Permite que bibliotecas de ativadores ou inibidores entendam a base mecanicista da formação de cicatrizes. Ensaios de triagem de alto rendimento de bibliotecas planas usando o modelo SCAD na compreensão do processo fundamental e do curso de moléculas envolvidos no reparo de feridas. O ensaio SCAD é fácil de realizar usando as explantas da pele.
Para uma cicatriz consistente, recomenda-se selecionar a pele do dia zero ou dia de pós-natal. Depois de sacrificar o dia zero ou o dia de um filhote recém-nascido pós-natal, use um bisturi cirúrgico estéril para extirpar cuidadosamente 1,5 por 1,5 centímetros de espessura total dorsal da pele dorsal até a camada muscular esquelética. Descasque a pele usando fórceps curvados estéreis, garantindo que a fáscia superficial esteja intacta com o músculo carnosus panniculus subjacente.
Lave o tecido excisado com 50 a 100 mililitros de meio DMEM F-12 frio para remover sangue contaminante. Em seguida, lave o tecido com hanks solução de sal equilibrado para manter a viabilidade tecidual e celular. Coloque a pele de cabeça para baixo com fáscia superficial por cima em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo meio DMEM F-12.
Em seguida, usando um ponche de biópsia descartável de dois milímetros, extirpar pedaços redondos de pele de espessura total para gerar tecidos comcadidos, garantindo que a fáscia superficial esteja intacta com o músculo carnosus panniculus subjacente até a epiderme. Adicione 200 microliters de MMEM F-12 completos sem fenol vermelho em cada poço de uma placa de 96 poços. Usando fórceps estéreis, transfira e submergir totalmente tecido carnado individual de cabeça para baixo para os poços de uma placa de 96 poços.
Transfira a placa para uma incubadora de cultura celular mantida em condições padrão. Nos dias dois e quatro da cultura, remova o meio deixando 10 microliters no poço e adicione o meio completo DMEM F-12 pré-aquecido fresco, juntamente com os compostos de tratamento para manter as condições contínuas de viabilidade celular e tecido. Para imagens ao vivo de SCADs, prepare 30 mililitros de solução de 2 a 3% de baixa fusão em PBS em uma garrafa de vidro aquecendo em um micro-ondas.
Depois de ferver, transfira imediatamente a garrafa e esfrie a solução de agarose líquida em um banho de água de 40 graus Celsius. Em seguida, transfira o tecido SCAD com fáscia ou cicatriz voltada para o centro de uma antena de 35 milímetros. Em seguida, incorpore o SCAD à temperatura ambiente, derramando lentamente 40 graus Celsius líquido surgido no tecido usando uma ponta de pipeta de 1000 microliter.
Agarose polimeriza em dois minutos. Após a polimerização, adicione dois mililitros de meio completo DMEM F-12 pré-aquecido. Em seguida, usando um microscópio confocal ou multifotônio equipado com sistemas de incubação adequados explicados no manuscrito, adquira imagens de lapso de tempo do dia zero ao primeiro dia.
Para a colheita de tecidos, lave os tecidos em pontos de tempo relevantes, substituindo a mídia por PBS estéril. Usando fórceps estéreis, transfira cada SCAD para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microliters de 2% paraformaldeído para fixar os tecidos durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave os tecidos três vezes com PBS antes de proceder à coloração de imunofluorescência bi ou tridimensional, conforme descrito no manuscrito do texto.
As imagens representativas de campo brilhante de SCADs nos dias zero e cinco são mostradas aqui. A coloração tricrômica do Masson de seções de tecido vertical revela assinaturas de cicatrizes teciduais, contração tecidual e acúmulo de matriz extracelular no núcleo da cicatriz nos dias zero e cinco. A coloração da imunofluorescência de SCADs nos dias zero e cinco são mostradas.
A partir da cicatriz do estágio inicial e tardio, o fibroblasto positivo arraigado é mostrado em verde e o fibroblasto negativo arraigado em vermelho. Para imagens tridimensionais, os tecidos foram incorporados na solução agarose e cobertos com PBSGT. As imagens representativas demonstram localização exclusiva da proteína N-cadherin no local da cicatriz de um SCAD de cinco dias.
A configuração de imagem tridimensional de lapso de tempo equipada com uma câmara de incubação exibiu os primeiros eventos de progressão dos enxames de fibroblastos durante as primeiras 12 horas ou estágios iniciais de desenvolvimento da cicatriz. A representação gráfica de trajetórias celulares rastreadas por células únicas de fibroblastos individuais sobre o desenvolvimento de cicatrizes é apresentada aqui. É crucial colocar o tecido SCAD de cabeça para baixo dentro da placa do poço para que a fáscia fique virada para cima.
O não cumprimento resultaria em variações inevitáveis nos padrões migratórios. Este procedimento permite examinar camadas dérmicas para tratamentos ou cultura usando moduladores químicos, anticorpos neutralizantes ou métodos virais. Isso ajuda na avaliação das respostas fibrológicas patológicas em diversos ambientes médicos.
Mostramos a expressão da connexin-43 e N-cadherin como moléculas-chave envolvidas na mobilização da fáscia ao ferir. A metodologia SCAD permite identificar novas estratégias terapêuticas para reduzir cicatrizes e fibrose.
