Investigar o comportamento da actina usando este protocolo é significativo porque permite ao usuário sondar a dinâmica do conjunto de proteínas motoras usando a precisão da armadilha óptica. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de medir a mecânica da miosina dentro da hierarquia estrutural da actina, em oposição à orientação tradicional de filamento único motor usada em muitos experimentos de aprisionamento óptico. Outra vantagem deste protocolo é a sua natureza modular, que permite ao usuário personalizar o ensaio para o sistema de citoesqueleto hierárquico de sua escolha.
Para começar, aplique dois pedaços de fita adesiva de dupla face no meio de um microscópio deslizando de três a quatro milímetros de distância um do outro. Em seguida, rasgue ou corte o excesso de fita que fica pendurado na borda do slide. Em seguida, adicione a tampa revestida de PLL em cima da fita perpendicular ao longo eixo da lâmina do microscópio para formar um canal.
Usando um pequeno tubo para comprimir a tampa deslize para a fita e o microscópio, deslize completamente até que a fita fique transparente, garantindo que não haja bolhas na fita, pois isso pode causar vazamento do canal de fluxo. Adicione 15 microlitros da actina de rodamina diluída à célula de fluxo PLL e passe o excesso de solução através da célula de fluxo, mas não permita que o canal de fluxo fique seco. Em seguida, incube por 10 minutos em uma câmara de umidade.
Em seguida, prepare uma solução de caseína de um miligrama por mililitro em tampão de polimerização de actina e adicione 15 microlitros da solução para evitar a ligação não específica dos componentes subsequentes. Em seguida, incube por cinco minutos em uma câmara de umidade. Depois, adicione a concentração desejada de miosina à suspensão de actina e grânulos biotinilados preparados e mexa suavemente com uma ponta de pipeta.
Em seguida, adicione imediatamente 15 microlitros da suspensão, juntamente com a concentração de miosina desejada, à célula de fluxo e incube por 20 minutos. Em seguida, sele as extremidades abertas da célula de fluxo com esmalte para evitar a evaporação durante os experimentos de imagem e aprisionamento óptico. Quando o sistema estiver pronto, ligue o laser usando o botão de energia a laser no canto inferior esquerdo da tela a 50 miliwatts e deixe-o estabilizar por 30 minutos.
Clique sequencialmente nos botões de iluminação, câmera, objetivo e movimento do palco dentro do software para abrir essas janelas para visualização e manipulação durante o experimento. Ligue a iluminação do microscópio clicando no botão Ligar/Desligar e definindo-o para a potência máxima, clicando e arrastando a barra até à direita. Abra a área da amostra e remova o suporte da amostra do estágio do microscópio.
Em seguida, adicione a célula de fluxo e prenda-a com os suportes de amostra de metal, garantindo que o deslizamento da tampa esteja no fundo. Depois, adicione 30 microlitros de água RO ao centro da objetiva inferior e reinsira o estágio da amostra. Em seguida, levante a objetiva inferior usando o L2 no controle remoto até que o talão de água toque o deslizamento da tampa.
Em seguida, abaixe a objetiva superior até que cerca de metade da distância até a célula de fluxo seja alcançada usando o R2 no controle remoto. Em seguida, adicione 170 microlitros de água RO ao topo da célula de fluxo diretamente sob a objetiva superior e abaixe a objetiva superior até quebrar a tensão superficial da água e formar um menisco. Posteriormente, mova o estágio do microscópio usando a almofada de seta no controle remoto até que a borda da fita adjacente ao canal de fluxo seja alcançada e, em seguida, feche a porta da amostra.
Usando a janela objetiva na tela, traga a borda da fita e o foco trazendo a objetiva inferior chamada Laser Objective para cima clicando na seta superior e a objetiva superior clicando na seta inferior usando os controles na tela. Encontre um grânulo flutuante e prenda-o clicando no botão do obturador do trap, que abrirá o obturador e permitirá que o laser de armadilha atinja a amostra. Em seguida, clique no cursor de interceptação na tela e arraste-o para mover a localização do laser de interceptação.
Uma vez preso, calibre o talão clicando no botão de calibração. Em seguida, clique em Configurações e digite o diâmetro do talão e a temperatura do palco encontrado no canto inferior esquerdo da janela do software. Em seguida, clique em Trap 1, depois em X Signal e execute o ajuste de frequência de canto clicando em Executar.
Em seguida, clique e arraste dentro da janela para otimizar o ajuste da função. Depois, clique em Usá-lo para valores de sensibilidade e rigidez e, em seguida, aceite os valores. Em seguida, feche a janela.
Encontre um feixe de actomiosina procurando por contas ligadas a FAs na superfície da folha de cobertura e procurando por ambas as FAs fluorescentes co-localizadas. Ligue a fonte de luz branca e use o cubo de filtro apropriado para obter a imagem de cada filamento de actina girando a torre. Uma vez verificado, prenda o talão preso ao filamento superior do feixe clicando no botão do obturador da armadilha.
Em seguida, registre os dados clicando no botão do osciloscópio usando os controles na tela. Para visualizar as medições sem registrar os dados, clique em Iniciar e, em seguida, clique em Salvar automaticamente para salvar todos os dados. Para registrar as medições, clique em Iniciar registro e escolha quais dados devem ser visualizados em tempo real, escolhendo no menu suspenso Sinal X ou Sinal Y.
O traço de força dos motores de miosina esquelética gerando força dentro da hierarquia estrutural de actina in vitro construída exibe rampa constante em força até que um platô seja atingido ao longo de dois a cinco minutos. No entanto, observa-se também que alguns feixes de actomiosina que não geram nenhuma força líquida e os traços de força aparecem como ruído de linha de base ou não exibem aumento líquido substancial da força ao longo de 90 segundos devido a uma baixa concentração de motor ou uma orientação paralela desfavorável dos filamentos. Este desenvolvimento de protocolo abrirá o caminho para a construção de ensaios citoesqueléticos in vitro mais complexos que ajudarão ainda mais a modelar tarefas celulares em larga escala, como divisão celular e contração muscular de baixo para cima.
