Nosso protocolo abre novas possibilidades para investigar como a replicação ocorre no DNA danificado. As técnicas podem detectar a formação e reparação de lacunas de DNA de um único fio, em frente à lesão de DNA. A nuclease S1 corta o DNA de uma única fenda e permite a detecção de lacunas pós-replicativas.
Essa abordagem foi usada pela primeira vez pelo Dr.Meneghini e pelo Dr.Cordiero-Stone na década de 1970 no Brasil, e recentemente adaptada por nós ao ensaio de fibra de DNA. O uso da técnica descrita aqui para estudar a formação e reparação de lacunas pós-replicativas pode fornecer insights sobre o mecanismo de reparação de DNA e resposta ao estresse de replicação que mantêm a integridade do genoma. Para ambos os protocolos descritos aqui, a fibra S1 e os ensaios de preenchimento de lacunas, é crucial incluir todos os controles para garantir uma interpretação precisa dos dados.
O procedimento será demonstrado por Davi J.Martins, doutorando do nosso laboratório, e dr. Annabel Quinet, colaborador que desenvolveu essas técnicas anteriormente ao trabalhar em nosso grupo. Para começar, aspire os meios de comunicação cultural e adicione imediatamente a mídia cultural com 20 micromolar de mídia IDU às células. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por precisamente 20 minutos.
Em seguida, lave rapidamente as células com PBS pré-aquecido duas vezes e irradie-as com 20 joules por metro quadrado UV-C. Use células não tratadas como controles. Adicione imediatamente a mídia com 200 micromolars cldU às células e incuba-as a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por precisamente 60 minutos.
Depois disso, lave as células com PBS pré-aquecido duas vezes e permeabiliza-as com o buffer CSK 100 por dois a 10 minutos de acordo com a linha celular à temperatura ambiente. Após a permeabilização do CSK, os núcleos com quase nenhum citoplasma podem ser vistos em comparação com aqueles anteriores à permeabilização. Despeje cuidadosamente o PBS pelo lado de cada poço para lavar os núcleos com PBS.
Em seguida, lave os núcleos com tampão S1. Incubar os núcleos no tampão S1 com 20 unidades por mililitro S1 nuclease, e sem a nuclease S1, por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, aspire o buffer S1 e adicione 0,1%BSA no PBS.
Raspe os núcleos e transfira-os para um tubo de 1,5 mililitro aproximadamente anotado. Mantenha os tubos no gelo o tempo todo. Centrifugar os núcleos em torno de 4.600 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Resuspende as pelotas em PBS a uma concentração de aproximadamente 1.500 células por microliter. Coloque os tubos no gelo e proceda imediatamente à preparação da fibra de DNA, espalhando o protocolo. Anote os slides do microscópio com um lápis de carbono e coloque-os em uma bandeja.
Toque na parte inferior do tubo para garantir a homogeneização e adicione dois microliters de células na parte superior do slide correspondente. Adicione seis microliters do tampão de lise e lise as células por tubulação para cima e para baixo cerca de cinco vezes. Use a ponta da pipeta para puxar a gota ligeiramente em direção ao fundo do slide e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente para lise os núcleos.
Incline o slide em torno de 20 a 40 graus e deixe que a gota se espalhe para o fundo do slide a uma velocidade constante de baixa velocidade. Deixe o slide secar à temperatura ambiente no escuro por 10 a 15 minutos. Em seguida, mergulhe-os em um frasco contendo a solução de fixação recém-preparada e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente para fixar DNA nas lâminas.
Lave os slides com PBS duas vezes por cinco minutos e desnatura o DNA com ácido cloridrico recém-preparado por 40 a 60 minutos em temperatura ambiente. Lave os slides com PBS três vezes por cinco minutos e bloqueie com 5%BSA previamente aquecido por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius. Toque suavemente no papel para remover o excesso de líquido dos slides.
Adicione 30 microliters de anticorpos primários aos slides e coloque um deslizamento de tampa em cima. Incubar por 1 a 1,5 horas em temperatura ambiente em uma câmara escura e úmida. Coloque os slides em um frasco com PBS por um a dois minutos e, em seguida, remova cuidadosamente os deslizamentos de cobertura.
Lave com PBST em um frasco três vezes por cinco minutos e coloque os slides em PBS. Remova o excesso de líquido tocando suavemente em um papel e adicione 30 microliters dos anticorpos secundários aos slides em sentido de gota. Coloque um deslizamento de cobertura em cima.
Incubar por 45 a 60 minutos em temperatura ambiente em uma câmara escura e úmida. Repita as etapas para lavar os slides e remova o excesso de PBS mais uma vez e adicione 20 microliters do reagente de montagem dropwise aos slides. Coloque um deslizamento de tampa em cima e evite bolhas.
Coloque uma gota de óleo de imersão perto do topo do escorregador onde as células foram lísedas. Use o canal verde e pesquise os pontos verdes no fundo para encontrar o foco. Abra o software Leica Application Suite, clique em Adquirir e selecione o canal verde.
Ajuste as configurações do canal verde antes da análise. Em seguida, mude para o canal vermelho e ajuste as configurações. Encontre a principal concentração de fibras e mova-se para as bordas para encontrar as fibras individuais bem espalhadas, não sobrepostas.
Use apenas um canal para selecionar as regiões para as imagens e evitar possíveis viés. Clique no ícone Adquirir sobreposição e ajuste o software para a ampliação correta do microscópio. Tire cerca de 15 a 20 fotos por slide ao lado de todo o slide no canal verde e, em seguida, no canal vermelho.
Os dois canais estão agora fundidos e a sobreposição criada é movida para uma pasta única. É possível ver as fibras com cores vermelha e verde. Abra o software ImageJ, clique no quinto ícone, selecione a segunda opção e selecione a ferramenta Linha Segmentada.
Clique à esquerda para desenhar o caminho exato do trato vermelho ou verde e clique à direita para parar o desenho. Pressione o botão M no teclado para medir o comprimento. Para a fibra S1, acompanhe as medidas dos tratos vermelho e verde para cada fibra e meça os comprimentos do trato vermelho e verde de pelo menos 150 fibras de diferentes imagens.
Uma fibra S1 é mostrada nessas imagens representativas. O trato de DNA nascente de controle sem as lacunas e impermeável ao decote pela nuclease S1 é mostrado aqui. O trato de DNA positivo para lacunas cortadas pela nuclease S1 resultou em um comprimento mais curto do trato cldu.
Um esquema de rotulagem diferencial amplamente descrito no manuscrito do texto pode ser realizado para rotular eventos de preenchimento de lacunas. Neste ensaio, chamado de ensaio de preenchimento de lacunas, faixas de IDU mais longas com pelo menos um patch de CLdU ou menos patches cldU correspondem a baixa densidade de preenchimento de lacunas. Os setores IDU mais curtos, com pelo menos um patch de CLDU, e os tratos de IDU mais longos com mais patches de CLDU, correspondem a alta densidade de preenchimento de lacunas.
A etapa de permeabilização deste protocolo é crucial para que a nuclease S1 atue nas lacunas formadas durante a replicação do DNA danificado. A nuclease S1 também pode ser usada no protocolo de ensaio de cometa para detectar as lacunas formadas durante a replicação do DNA danificado que persiste após o tratamento. O ensaio de fibras S1 abriu caminho para o novo paradigma de que lacunas pós-replicativas podem causar vulnerabilidade ao câncer, particularmente em cânceres de mama e ovário que carregam mutações nos genes BRCA1 e 2.
