Este protocolo fornece diretrizes passo a passo para uma rota reprodutível de acesso a regiões de interesse no tronco cerebral caudal e no cordão cervical superior. Esta técnica aumenta a precisão ao fornecer pequenos volumes de injeção para regiões restritas de interesse no tronco cerebral caudal e cordão cervical superior. Esta técnica tem sido e pode ser aplicada a outros modelos animais.
Veronique VanderHorst, professora associada de neurologia e principal pesquisadora do Laboratório VanderHorst, demonstrará este procedimento. Certifique-se de que o fluxo de oxigênio está direcionado para o cone do nariz. Mova o mouse para a estrutura estereotaxa e coloque o nariz em um cone de nariz flexível.
Coloque o mouse no quadro estereotaxic usando apenas barras de ouvido. Coloque lubrificante nos olhos. Anteroflexe a cabeça do rato para um ângulo de 90 graus guiando manualmente o nariz.
Para fixar essa posição, coloque uma barreira plástica entre os pilares da barra de ouvido do adaptador do mouse paralelamente aos pilares com a parte plana do crânio servindo como referência. Coloque a almofada de aquecimento por baixo do mouse e certifique-se de que o pescoço e o resto do corpo estejam posicionados paralelamente à mesa, elevando o corpo com uma pequena caixa. Coloque uma cortina debaixo do corpo.
Injete uma única dose de quatro miligramas por quilograma Meloxicam liberação lenta subcutânea a um volume de dois microliters por grama de peso corporal. Limpe o local de incisão cirúrgica primeiro com uma almofada de preparação de 70%, depois com uma almofada de preparação betaine, e depois novamente com uma almofada de preparação para álcool e deixe secar. Desinfete as mãos e coloque luvas estéreis, em seguida, coloque uma cortina no local cirúrgico.
Certifique-se de que o mouse está apropriadamente anestesiado apertando os dedos dos dedos ou verificando o reflexo da córnea. Reduza o isoflurane para manter os níveis em 2.0. Faça uma incisão de um a 1,2 centímetros com uma lâmina cirúrgica de 10 da borda do osso occipital em direção aos ombros em um movimento suave.
Faça cuidadosamente uma incisão na linha média do músculo trapézio, expondo os músculos longus capitis emparelhados. Coloque ambos os ganchos retraídos entre os músculos longus capitis emparelhados, um orientado para a esquerda e outro para a direita. Use os fórceps de laminectomia contundente para separar as barrigas esquerda e direita do músculo longus capitis emparelhado, começando a partir da occiput onde a linha média é prontamente visível.
Guie os fórceps contundentes através do osso da occiput na linha média até onde ele encontra a dura gêmea cisterna e, em seguida, continuar através da dura mater para o atlas. Reposicione os retratores e ajuste a tensão reposicionando os hemostats. Use os fórceps de laminectomia contundente para separar os músculos ainda mais na linha média para obter uma boa visão do tronco cerebral e do cerebelo.
Repita o procedimento acima conforme necessário até que o cerebelo e o tronco cerebral apareçam abaixo da dura. Usando fórceps de laminectomia contundente, limpe a dura dura dos pequenos fios do tecido conjuntivo movendo os fórceps da linha média em direção lateral até que haja uma visão clara do tronco cerebral, criando mais espaço lateral. Veja a superfície dorsal do tronco cerebral com marcos detalhados através da dura abertura.
Use os fórceps angulares para pegar a dura dura estendendo-se do osso occipital até o atlas, em seguida, use a tesoura de mola para fazer uma pequena abertura de aproximadamente 0,5 a 1,5 milímetros na dura. Uma vez aberto o dura, escorra o excesso de fluido cefalorraquidiano com uma ponta Q estéril. O obex, o ponto onde o canal central se abre para o quarto ventrículo, é o ponto zero anterior-posterior e mediolateral padrão.
Posicione a pipeta ou a seringa ao alvo usando o braço estereotaxic. Abaixe o braço da dorsal sobre a superfície dorsal que se forma a partir do ponto zero dorsoventral. Em seguida, abaixe a pipeta no tronco cerebral e injete a solução.
Deixe a agulha no lugar por um a cinco minutos após a injeção para evitar uma pista de agulha ao usar volumes entre três a 50 nanoliters. Em seguida, levante a pipeta ou a seringa usando o braço estereotax e repita isso para vários alvos. Remova os ganchos cuidadosamente do campo cirúrgico.
Os músculos longus capitis emparelhados cairão de volta em uma posição neutra cobrindo totalmente a cisterna magna. Não feche o músculo trapézio e a dura-costura na linha média, pois eles são muito frágeis para segurar suturas. Feche a pele com 3 suturas de nylon ou polipropileno.
A abordagem cisterna magna torna possível atingir as estruturas do tronco cerebral caudal e do cordão cervical superior que são de outra forma difíceis de alcançar através de abordagens estereotaxas padrão ou são propensas a alvos inconsistentes. Em camundongos, estruturas como o núcleo hipoglossal, o grupo respiratório ventral e a formação reticular adjacente no tronco cerebral caudal têm sido rotineiramente alvo usando a abordagem cisterna magna, conforme ilustrado aqui para o núcleo hipoglossal e a medula ventromedial. A fim de determinar a precisão da abordagem cisterna magna versus a abordagem padrão, a distância entre os locais alvo pretendidos e reais nos planos anteroposterior, mediolateral e dorsoventral para regiões ventral e dorsal foi medida.
Os resultados mostram erros significativamente menores nos planos anteroposterior, mediolateral e dorsoventral em comparação com a abordagem padrão, destacando a precisão aprimorada da abordagem cisterna magna para esses alvos. Ao tentar este protocolo, é fundamental garantir que a anteroflexão da cabeça e a elevação do corpo seja realizada como descrito. Em seguida, é importante reconhecer os principais marcos antes de manipular o músculo ou a dura-mater.
Se esses marcos não forem reconhecidos ou perdidos, será desafiador manter-se orientado e executar o procedimento como planejado. Essa técnica ajudou a abordar questões conceituais relacionadas à organização anatômica funcional dentro do tronco cerebral caudal e da corda cervical superior.
