Os zebrafish oferecem um modelo valioso de regeneração neural devido à sua capacidade de se recuperar da lesão medular. Este método descreve a resistência à natação e o comportamento de natação como leituras de reparação funcional da medula espinhal. Esta técnica fornece avaliação confiável e quantificável da resistência à natação e comportamento de natação em zebrafish adultos.
Esses métodos são igualmente aplicáveis aos estudos de desenvolvimento neuromuscular e musculoesquelético, doença e regeneração. Para avaliar a resistência à natação, abra o software de controle de velocidade de fluxo. Clique na caixa rotulada Experiment e desmarque Uswim e Uwater.
Em seguida, altere a velocidade de fluxo na caixa Uwater no canto inferior esquerdo para ajustar as velocidades de corrente de água. Para iniciar um protocolo automatizado, clique na caixa de registro Iniciar. Na janela de diálogo que abre, escolha Automatizado na lista suspensa.
Para abrir um arquivo de protocolo previamente salvo, clique no ícone de arquivo ao lado do arquivo de protocolo. Em seguida, configure o arquivo de saída clicando no ícone do arquivo ao lado do arquivo de registro. Na janela do explorador de arquivos que abre, nomeie o arquivo de saída e salve-o no local desejado.
Em seguida, configure uma janela de temporizador de volta dividida para garantir acesso simultâneo ao software de controle de velocidade de fluxo e janelas temporizadoras na tela do computador. Em seguida, montar um tanque de coleta de peixes para abrigar os peixes exaustos após sua remoção do túnel de natação. Encha o tanque de coleta e um longo tubo de cloreto de polivinil com água do sistema de zebrafish.
Coloque uma extremidade do tubo pré-preenchido no tanque de coleta e outra no tanque de buffer, garantindo que a água possa fluir livremente do tanque tampão para o tanque de coleta. Fixar a extremidade superior do tubo com um clipe de aglutinante para evitar o fluxo de água e use o clipe de aglutinante para controlar o fluxo de água conforme necessário. Feche o túnel de natação com a tampa de resistência ao nado antes de colocar um grupo de peixes dentro do túnel de natação.
Para aclimatar o peixe ao túnel de natação e à direção de fluxo, inicie o temporizador de volta fracionada e ajuste a velocidade atual para zero centímetros por segundo durante os primeiros cinco minutos, nove centímetros por segundo durante os próximos cinco minutos e 10 centímetros por segundo durante os cinco minutos seguintes. Após a aclimatação, abra o protocolo e inicie o programa automatizado de controle de velocidade de fluxo, que aumentará a velocidade da corrente de água em dois centímetros por segundo a cada minuto. Monitore o peixe para exaustão.
Peixes exaustos serão empurrados para a parte de trás do túnel de natação. Para garantir que um peixe esteja exausto, bata suavemente na parte de trás do túnel ou crie uma sombra sobre aquela área para estimular o peixe a nadar. Peixes exaustos não responderam ao estímulo do início e ficaram deitados na parte de trás do túnel.
Quando um peixe está exausto, despreste o tubo de coleta de peixes. Abra a janela do túnel de natação e colete os peixes no tanque de coleta. Registo o tempo de exaustão usando o temporizador de volta dividida.
Depois de todos os peixes esgotados e coletados no tanque de coleta, clique no botão De parada de emergência no software de controle de velocidade de fluxo e pare o temporizador. Para capturar filmes para o ensaio de comportamento de natação, coloque um grupo de peixes no túnel de natação e feche o túnel usando uma tampa padrão e totalmente fechada. Em seguida, abra uma nova janela de gravação e nomeie o arquivo.
Não clique em Gravar ainda. Antes de iniciar um novo experimento, coloque uma toalha de papel ou um pedaço de tecido na lateral do túnel de natação para garantir que todos os comportamentos sejam devidos à natação de peixes, e não devido a uma resposta de esacada causada pelo movimento no ambiente. Depois de garantir que a água está calma e que nenhuma ondulação está se movendo através do quadro, clique em Gravar na janela do software da câmera para começar a gravar o arquivo do filme.
Em seguida, clique em Iniciar no software de controle de velocidade de fluxo para iniciar o protocolo, que continuará ininterrupto. Assista ao filme para garantir que nenhum quadro seja descartado, não há bolhas no campo de visão, e todos os peixes são registrados. Uma vez que a gravação do filme seja concluída, clique em Parar de Emergência para terminar o protocolo de controle de velocidade de fluxo e verifique se o arquivo de saída de dados é salvo automaticamente.
Em seguida, feche a janela de gravação para salvar o arquivo do filme. Após a gravação, remova a tampa. Recupere cuidadosamente os peixes e devolva-os ao tanque.
Para analisar os filmes capturados, abra o tracking_v2. ijm script em Fiji e clique em Executar para começar o programa. Na janela pop-up, escolha a pasta que contém os filmes de comportamento de natação para rastrear e clicar em Abrir.
Procure um quadro do primeiro filme, uma caixa de diálogo, e a região de interesse, ou gerente de ROI, que virá à tona. Siga as instruções dadas na caixa de diálogo e crie um ROI na parte inferior da câmara do túnel de natação. Em seguida, clique em OK e certifique-se de que não são vistos cantos pretos.
A janela limiar será aberta juntamente com um quadro editado com limiar. Mude o esquema de cores de preto e branco para vermelho e ajuste o valor máximo até que o quadro um só mostre o peixe em vermelho e nada mais. Regissua o limiar e clique em OK na caixa de diálogo.
Para alinhar, montar e adquirir estatísticas descritivas, abra o SwimBehavior_v7-3. Script R no RStudio e clique em Fonte no canto superior direito da seção script. Em uma nova janela que se abre, escolha a pasta que contém o _raw.
csv arquivos gerados por Fiji e clique em Abrir. O programa será executado automaticamente. Na caixa de diálogo pop-up, confirme o número de peixes em cada filme.
Clique em Sim, se os números indicados estiverem corretos ou não, se os números estiverem incorretos. Uma vez que os arquivos estejam alinhados, verifique se há um _aligned recém-gerado. arquivo csv.
Depois de garantir que o programa combine os dados, execute estatísticas e plote gráficos de saída, verifique os arquivos de análise gerados em uma nova pasta rotulada Resultados dentro da pasta pai contendo o _raw. csv e _aligned. arquivos csv.
A resistência ao natação avaliada em duas, quatro e seis semanas após a lesão mostrou uma perda de 60% da capacidade de resistência na natação em duas semanas. Os peixes regeneradores gradualmente recuperaram a resistência na natação em quatro e seis semanas após a lesão. No ensaio de comportamento de natação, os controles nadavam constantemente na parte frontal da câmara do túnel de natação correspondente a uma posição Y elevada.
Em contrapartida, com duas semanas após a lesão, os peixes feridos não conseguiam manter a capacidade de natação constante contra a correnteza. Consequentemente, suas pistas de natação são mais irregulares, com uma queda geral na posição Y. A posição y aumentou em quatro e seis semanas após a lesão, indicando que animais regeneradores gradualmente recuperaram sua capacidade de nadar.
Além disso, em relação aos controles não feridos, os animais lesionados com duas semanas após a lesão foram marcadamente menos ativos, parados no quadrante traseiro do túnel de natação, e perderam sua capacidade de nadar contra velocidades de baixa corrente. Consistente com sua capacidade inata de alcançar a recuperação funcional, os animais lesados gradualmente normalizaram os parâmetros de comportamento de natação em quatro e seis semanas após a lesão. O uso do software de controle de velocidade de fluxo neste protocolo é opcional.
A alternativa é controlar manualmente o motor de corrente de água. Os ensaios descritos neste estudo podem ser usados para pré-triagem para fenótipos neurais, musculares ou esqueléticos. O tecido de interesse pode então ser colhido para exame histológico ou molecular.
Nosso laboratório e outros usaram este protocolo para identificar genes necessários para reparação neural inata e fatores que são suficientes para melhorar a regeneração neural.
