O objetivo geral deste procedimento é fabricar hidrogéis de micro-padrão para estudos de microscopia de força de tração 2D. Isso é feito primeiro fazendo um deslizamento de tampa de vidro metacrilatado e formando a primeira camada de um hidrogel de poliacrilamida sobre ele. O segundo passo é criar outra camada de hidrogel contendo contas fluorescentes para microscopia de força de tração.
O hidrogel é sanduíche com um deslizamento de cobertura de micro-padrão em cima dele, resultando na transferência das proteínas de matriz de micro-padrão na superfície do hidrogel. Em seguida, o hidrogel de poliacrilamida é deixado para polimerizar à temperatura ambiente por 45 minutos. O deslizamento da tampa superior é então cuidadosamente removido.
A imagem de microscopia de fluorescência é usada para mostrar a presença das contas e a transferência bem sucedida de proteínas de matriz extracelular micro-padronizadas. Este método ajuda a medir de forma eficiente e precisa várias forças de tração usando a luz e usar a liberação de células. Possibilitando a obtenção de um maior número de observações experimentais a partir da mesma amostra.
Então, demonstrando o procedimento será Joel Christian, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Adicione 10 mililitros de água dupla destilada em um béquer. Depois, adicione 18,75 mililitros de ácido acético, 18,75 mililitros de metacrilato de 3 propil e 252,5 mililitros de etanol à solução.
Quando a solução estiver completa, transfira-a para um prato cristalizador. Pegue deslizamentos de cobertura redondas de 24 milímetros, limpe-os com uma limpeza de precisão e coloque-os em um rack de teflon feito sob medida. Em seguida, mergulhe-o na solução e incubar por 15 minutos.
Pegue o rack e enxágue-o com etanol. Seque os deslizamentos de cobertura sob o fluxo de ar. Os deslizamentos de cobertura com metanfetamina podem ser armazenados até um mês à temperatura ambiente.
Pegue um deslizamento de cobertura redonda de 15 milímetros e coloque-o em uma placa de Petri. Use uma caneta de diamante para marcar o lado superior do deslizamento da tampa. Em seguida, prossiga para a limpeza através do tratamento de plasma de oxigênio.
O deslizamento da tampa é limpo a 0,4 milibar e 200 Watts por dois minutos. Pipeta 100 microliters de 0,01% da solução Poly-L-Lysine na superfície do deslizamento de cobertura e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente. Depois, lave o deslizamento da tampa com 10 mililitros a um pH de 8,5.
Tire o excesso de líquido, mas mantenha a superfície molhada. Pipeta 100 microlitres de 50 miligramas por mililitro de mPEG-SVA em solução pH 8.5 de 10 milimilhas na superfície do deslizamento de cobertura e incubar por uma hora à temperatura ambiente. Depois, enxágue os deslizamentos de cobertura com 10 milimililar pH 8.5.
Em seguida, adicione dois microliters de gel PLPP seguido por 40 microliters de etanol na superfície. Incline suavemente a placa de Petri para homogeneizar a solução. Aguarde cinco minutos para a solução polarizar.
Coloque o deslizamento de tampa dentro de uma placa de Petri de 35 milímetros. Coloque a placa de Petri contendo o deslizamento de tampa no estágio do microscópio. Ajuste o foco na superfície do vidro.
Carregue e bloqueie o padrão pré-desenhado. Inicie a padronização por dose UV de 30 milijoules por milímetro ao quadrado. Depois de completar a etapa de padronização, tire o deslizamento da tampa padrão e enxágue a superfície com PBS.
Incubar a amostra com uma mistura de 100 microliter de 25 microgramas por fibronectina mililitro e 25 microgramas por fibrinogênio mililitro conjugado com Alexa 488 dissolvida em PBS por uma hora a temperatura ambiente. Para preparar o substrato de hidrogéis, comece colocando a tampa metacrilatada em uma placa de Petri. Para começar, prepare a solução AgA oxidada fresca adicionando 9,55 mililitros de água dupla destilada em um tubo Falcon de 15 mililitros.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros de AgA. Em seguida, adicione 42 miligramas de meta piruvato de sódio à solução. Coloque a solução no agitador por quatro horas.
Em seguida, prepare a solução de estoque misturando acrilamida, bis-acrilamida e água dupla destilada de acordo com a Tabela 1. A solução de estoque pode ser mantida por até um ano a quatro graus Celsius. Prepare a solução de trabalho para a camada inferior misturando 99,3 microliters de solução de estoque com 0,5 microliters de persulfeto de amônio 1% e 0,2 microliters de TEMED.
Pegue 10 microliters da solução e pipeta em forma de gota no deslizamento de cobertura metacrilatado. Coloque cuidadosamente uma tampa redonda de 15 milímetros na gota e espere 45 minutos para que ela polimerize. Em seguida, desprender o deslizamento de tampa superior com o bisturi.
Em seguida, prepare a solução de trabalho para a camada superior misturando 93,3 microliters de solução de estoque com um HEA oxidado microliter, cinco microliters contas fluorescentes, 0,5 microliters de persulor de amônio 1% e 0,2 microliters de TEMED. Pegue cinco microliters da solução e pipeta-o em forma de gota no hidrogel da camada inferior. Coloque cuidadosamente um deslizamento de tampa de micro-padrão na gota.
Espere 45 minutos para polimerizar. Desprender suavemente o deslizamento da tampa com um bisturi. E cole a tampa escorregar no fundo de uma placa personalizada perfurada de seis poços.
Adicione PBS aos poços. Para ver as células, aspire o PBS da placa de seis poços. Para fibroblastos, adicione DMEM de alta glicose contendo L-glutamina e suplemente-a com 10% FPS e 1%penicilina e estreptomicina.
Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Ligue o CO2 e o aquecimento para o estágio de microscopia. Em seguida, ligue o microscópio e coloque a placa do poço no palco.
Configure o padrão de iluminação e marque células de interesse. Refoce-se na superfície do hidrogel. Adquira a imagem das células no canal brightfield.
Para tirar a imagem das contas no estado deformado, mude para o canal. Em seguida, mude para o canal laser e ilumine a célula de acordo com o padrão por três minutos. Isso corresponde a uma dose de 6.000 milijoules por milímetro ao quadrado.
Depois, mude o canal e adquira a imagem das contas no estado não deformado. Para calcular as forças de tração, abra as imagens fluorescentes que já corrigidas para a deriva lateral. A análise completa das forças de tração está detalhada no script anexado.
Para verificar a adesão seletiva das células às regiões micro-padronizadas na superfície dos hidrogéis, as amostras foram imagens com microscopia fluorescente utilizando proteínas de matriz pré-rotuladas e com microscopia de campo brilhante para visualizar células. As propriedades mecânicas dos hidrânis de poliacrilamida foram variadas misturando diferentes quantidades de acrilamida e bis-acrilamida. A rigidez do hidrogel foi avaliada com experimentos de nanoindação por microscopia de força atômica.
As medições de força de tração foram realizadas após a aplicação de uma iluminação espacial, temporalmente controlada, de laser ultravioleta para iluminar seletivamente regiões do tamanho de micron do hidrogel poliacrilamida. As forças de tração foram reconstruídas utilizando-se fttc regularizado com parâmetro de regularização escolhido por validação cruzada generalizada. Nossa abordagem modular modelo baseada na microscopia de força de atração combinada com a liberação de luz e uso de células de micro-padrão é versátil e poderia ser ainda mais explorada com outras configurações de microscopia e imagem para melhorar sua resolução e sensibilidade.
