L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fabbricare idrogel di micro-pattern per studi di microscopia a forza di trazione 2D. Ciò si ottiene facendo prima scivolare una copertura in vetro metacrilato e formando il primo strato di un idrogel di poliacrilammide su di esso. Il secondo passo è quello di creare un altro strato di idrogel contenente perline fluorescenti per la microscopia della forza di trazione.
L'idrogel è inserito con una copertura micro-pattern slip sopra di esso, con conseguente trasferimento delle proteine della matrice micro-pattern sulla superficie dell'idrogel. Successivamente, l'idrogel di poliacrilammide viene lasciato polimerizzare a temperatura ambiente per 45 minuti. Lo slip del coperchio superiore viene quindi rimosso con cura.
L'imaging al microscopio a fluorescenza viene utilizzato per mostrare la presenza delle perline e il trasferimento di successo di proteine della matrice extracellulare micro-modellate. Questo metodo aiuta a misurare in modo efficiente e preciso diverse forze di trazione utilizzando la luce e utilizzare il rilascio di cellule. Rendendo possibile ottenere un maggior numero di osservazioni sperimentali dallo stesso campione.
Quindi a dimostrare la procedura sarà Joel Christian, uno studente laureato del mio laboratorio. Aggiungere 10 millilitri di acqua doppia distillata in un becher. Successivamente, aggiungere 18,75 millilitri di acido acetico, 18,75 millilitri di metacrilato di 3-propile e 252,5 millilitri di etanolo alla soluzione.
Quando la soluzione è completa, trasferirla in un piatto cristallizzante. Prendi i coperchi rotondi da 24 millimetri, puliscili con una salvietta di precisione e mettili in un rack in teflon su misura. Quindi immergerlo nella soluzione e incubare per 15 minuti.
Prendi il rack e risciacqualo con etanolo. Asciugare il coperchio scivola sotto il flusso d'aria. Gli slip di copertura metacrilati possono essere conservati fino a un mese a temperatura ambiente.
Prendi un coperchio rotondo da 15 millimetri e mettilo su una capsula di Petri. Utilizzare una penna diamantata per contrassegnare il lato superiore della scivolata di copertura. Quindi procedere alla pulizia tramite trattamento al plasma di ossigeno.
Lo slittamento del coperchio è pulito a 0,4 millibar e 200 Watt per due minuti. Pipettare 100 microlitri dello 0,01% di soluzione di Poli-L-Lisina sulla superficie del coperchio scivolare e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare il coperchio con 10 millimolari ad un pH di 8,5.
Estrarre il liquido in eccesso, ma mantenere la superficie bagnata. Pipettare 100 microlitri da 50 milligrammi per millilitro di mPEG-SVA in soluzione di pH 8,5 da 10 millimolari sulla superficie del coperchio scivolare e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo, risciacquare il coperchio scivola con pH 10 millimolare 8,5.
Quindi aggiungere due microlitri di gel PLPP seguiti da 40 microlitri di etanolo sulla superficie. Inclinare delicatamente la capsula di Petri per omogeneizzare la soluzione. Attendere cinque minuti affinché la soluzione si polarizzi.
Posizionare il coperchio all'interno di una capsula di Petri con foro inferiore di 35 millimetri. Metti la capsula di Petri contenente il coperchio sul palco del microscopio. Regolare la messa a fuoco sulla superficie del vetro.
Caricare e bloccare la serie pre-disegnata. Iniziare il pattern con la dose UV di 30 millijoule per millimetro quadrato. Dopo aver completato la fase di creazione del modello, estrarre la scivolata del coperchio del modello e risciacquare la superficie con PBS.
Incubare il campione con una miscela di 100 microlitri di 25 microgrammi per millilitro fibronectina e 25 microgrammi per millilitro fibrinogeno coniugato con Alexa 488 disciolto in PBS per un'ora a temperatura ambiente. Per preparare il substrato di idrogel, iniziare con il mettere la copertura metacrilata in una capsula di Petri. Per iniziare, preparare una soluzione di AgA appena ossidata aggiungendo 9,55 millilitri di acqua doppia distillata in un tubo Falcon da 15 millilitri.
Quindi aggiungere 0,5 millilitri di AgA. Quindi aggiungere 42 milligrammi di meta piruvato di sodio alla soluzione. Impostare la soluzione sullo shaker per quattro ore.
Quindi preparare la soluzione madre mescolando acrilammide, bis-acrilammide e acqua doppia distillata secondo la Tabella 1. La soluzione madre può essere conservata fino a un anno a quattro gradi Celsius. Preparare la soluzione di lavoro per lo strato inferiore mescolando 99,3 microlitri di soluzione madre con 0,5 microlitri di persolfato di ammonio 1% e 0,2 microlitri di TEMED.
Prelevare 10 microlitri dalla soluzione e dalla pipetta a goccia sul coperchio metacrilato. Posizionare con attenzione un coperchio rotondo da 15 millimetri sulla goccia e attendere 45 minuti affinché polimerizzi. Quindi, staccare il coperchio superiore scivolare con il bisturi.
Quindi preparare la soluzione di lavoro per lo strato superiore mescolando 93,3 microlitri di soluzione madre con un HEA ossidato a microlitri, cinque microlitri perle fluorescenti, 0,5 microlitri di persolfato di ammonio 1% e 0,2 microlitri di TEMED. Prendi cinque microlitri dalla soluzione e pipettala a goccia sull'idrogel dello strato inferiore. Posizionare con attenzione una copertura micro-pattern sulla goccia.
Attendere 45 minuti affinché polimerizzi. Staccare delicatamente il coperchio scivolare con un bisturi. E incolla il coperchio scivola sul fondo di una piastra a sei pozzetti forata personalizzata.
Aggiungi PBS ai pozzi. Per vedere le cellule, aspirare il PBS dalla piastra a sei pozzetti. Per i fibroblasti, aggiungere DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente L-glutammina e integrarlo con 10% FPS e 1% penicillina e streptomicina.
Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Accendere la CO2 e il riscaldamento per la fase di microscopia. Quindi accendere il microscopio e posizionare la piastra del pozzo sul palco.
Impostare il modello di illuminazione e contrassegnare le celle di interesse. Rimettere a fuoco sulla superficie dell'idrogel. Acquisire l'immagine delle celle nel canale brightfield.
Per scattare l'immagine delle perline nello stato deformato, passare al canale. Quindi passare al canale laser e illuminare la cella secondo il modello per tre minuti. Ciò corrisponde a una dose di 6.000 millijoule per millimetro quadrato.
Dopo, cambia canale e acquisisci l'immagine delle perline nello stato non deformato. Per calcolare le forze di trazione, apri le immagini di perline fluorescenti che hanno già corretto per la deriva laterale. L'analisi completa delle forze di trazione è dettagliata nello script allegato.
Per verificare l'adesione selettiva delle cellule alle regioni micro-modellate sulla superficie degli idrogel, i campioni sono stati ripresi con microscopia fluorescente utilizzando proteine della matrice pre-marcate e con microscopia a campo luminoso per visualizzare le cellule. Le proprietà meccaniche degli idrogel di poliacrilammide sono state variate mescolando diverse quantità di acrilammide e bis-acrilammide. La rigidità dell'idrogel è stata valutata con esperimenti di nanoindentazione mediante microscopia a forza atomica.
Le misurazioni della forza di trazione sono state eseguite dopo aver applicato un'illuminazione a fascio laser ultravioletto spaziale, controllata temporalmente, per illuminare selettivamente regioni di dimensioni micron dell'idrogel di poliacrilammide. Le forze di trazione sono state ricostruite utilizzando FTTC regolarizzato con un parametro di regolarizzazione scelto mediante validazione incrociata generalizzata. Il nostro approccio modulare basato sulla microscopia a forza di attrazione combinato con la luce e il rilascio di micro-pattern è versatile e potrebbe essere ulteriormente sfruttato con altre impostazioni di microscopia e imaging per migliorarne la risoluzione e la sensibilità.
